Summary
Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.
Abstract
Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos os fármacos aprovados pela FDA para o tratamento do mieloma múltiplo, induzem a ubiquitinação e degradação dos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3) através da ligase da ubiquitina do Cereblon (crbn) E3 para a degradação degradação. Imids têm sido utilizados recentemente para a geração de proteólise bifuncional visando quimeras (protacs) para direcionar outras proteínas para a ubiquitinação e degradação degradação pela ligase da crbn E3. Foram projetados e sintetizados os PROTACs homobifuncionais à base de pomalidomida e analisados sua capacidade de induzir a ubiquitinação e degradação autodirigida de CRBN. Aqui, o CRBN serve como ambos, a ligase da ubiquitina E3 e o alvo ao mesmo tempo. O composto de Homo-PROTAC 8 degrada o crbn com uma potência elevada com somente efeitos permanecendo mínimos em IKZF1 e em IKZF3. A inactivação de crbn pelo composto 8 não teve nenhum efeito na viabilidade da pilha e na proliferação de linhas de pilha múltiplas diferentes do mieloma. Este Homo-ProTac AB roga os efeitos de imids em pilhas múltiplas do mieloma. Portanto, nossos compostos à base de pomalidomida bacteriana podem ajudar a identificar os substratos endógenos e as funções fisiológicas da crbn e investigar o mecanismo molecular dos imids.
Introduction
Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos aprovados para o tratamento do mieloma múltiplo, ligam-se ao E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), um adaptador de substrato para cullin4A-RING E3 ligase de ubiquitina (CRL4crbn)1,2,3. A vinculação de imids aumenta a afinidade deCRL4 crbn aos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3), levando à sua ubiquitinação e degradação (Figura 1)4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. Since IKZF1 e IKZF3 são essenciais para pilhas múltiplas do mieloma, seus resultados da inactivação na inibição do crescimento. SALL4 foi encontrado recentemente como um neosubstrato Imid-induzido adicional do crbn que é provável responsável para o teratogenicidade e a catástrofe assim chamada de Contergan nos 1950s causados por talidomida9,10. Em contraste, a caseína quinase 1 α (CK1α) é um substrato específico da lenalidomida de CRBN que está implicado no efeito terapêutico na síndrome mielodisplásica com deleções do cromossomo 5q11.
A capacidade de pequenas moléculas para atingir uma proteína específica para a degradação é uma implicação emocionante para o desenvolvimento de drogas modernas. Embora o mecanismo de talidomida e seus análogos foi descoberto após seu primeiro uso em seres humanos, assim chamado PROteólise targeting Chimeras (protacs) foram projetados para direcionar especificamente uma proteína de interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs são as moléculas heterobifuncionais que consistem em um ligante específico para o POI conectado através de um linker a um ligante de uma ligase da ubiquitina E3 como crbn ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induzem a formação de um complexo ternário transitório, direcionando o POI para a ligase da ubiquitina E3, resultando em sua ubiquitinação e degradação degradação. As principais vantagens do PROTACs sobre os inibidores convencionais é que a ligação a um POI é suficiente, em vez de sua inibição e, portanto, PROTACs pode potencialmente alvo de um espectro muito maior de proteínas, incluindo aqueles que foram considerados undruggable como fatores de transcrição15. Além disso, as moléculas quiméricas atuam catalisando e, portanto, têm uma alta potência. Após a transferência do ubiquitin ao POI, o complexo ternário dissocia e está disponível para a formação de complexos novos. Assim, as concentrações muito baixas de PROTAC são suficientes para a degradação da proteína-alvo23.
Aqui nós descrevemos a síntese de um pomalidomide-pomalidomide conjugado Homo-ProTac (composto 8) que recruta crbn para a degradação DSE24. A ligase da ubiquitina E3 CRBN atua como recrutador e alvo ao mesmo tempo (Figura 3). Para validar nossos dados, também sintetizamos um controle de ligação negativa (composto 9). Nossos dados confirmam que o recém-sintetizado Homo-PROTAC é específico para a degradação de CRBN e tem somente efeitos mínimos em outras proteínas.
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Protocol
1. preparação de moléculas PROTAC
Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de usar. Diversos dos produtos químicos usados nestas sínteses são tóxicos e carcinogénicos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção pessoal.
- Preparação de carbamato de tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) (composto 1)
- Adicionar 1, 1 '-carbonildiimidazol (1,95 g, 12 mmol) e uma quantidade catalítica de 4-(dimetilamino) piridina (5 mg) a uma mistura de BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) em THF (50 mL) em 100 mL balão de fundo redondo com um stir bar e equipado com um condensador de refluxo Aqueça no reflux por 10 h ao agitar até que uma solução desobstruída esteja dada forma.
- Retire o solvente pressão reduzida com um evaporador rotativo, adicione EtOAc (200 mL) e transfira-o para um funil separatório. Lave a camada orgânica com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml) e seque-a sobre na2so4.
- Filtre a solução através de uma almofada curta de sílica gel (5 cm de diâmetro e 5 cm de altura) e Eluar com um volume adicional (200 mL) de EtOAc.
- Evate o solvente e seque o sólido incolor obtido no vacuo.
- Preparação de carbamato de tert-butil N-(1-metil-2, 6-dioxo-3-piperidilo) (composto 2)
- Combine composto 1 (2,28 g, 10 mmol) com carbonato de potássio fresado (2,76 g, 20 mmol) e Dmf (25 ml) em um balão de fundo redondo de 100 ml. Adicionar Iodometano (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) gota-sábio usando uma seringa e equipar o balão com um septo de borracha perfurado. Coloque o vaso de reação em um banho de ultrasonication para 2 h.
- Diluir a mistura de reacção com EtOAc (100 mL) e transferi-la para um funil separatório. Lave a camada orgânica com 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml), e salmoura (25 ml), e seque-o sobre na2so4.
- Filtre e evate o solvente. Purificar o produto por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (6 cm de diâmetro da coluna e 20 cm de altura) usando éter de petróleo/EtOAc (2:1).
- Preparação de 2-(2, 6-dioxopiperidina-3-yl)-4-fluoroisoindolina-1,3-diona (composto 3)
- Combine 3-fluorophthalic anidrido (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimida 1 (1,14 g, 5 mmol) e uma solução de acetato de sódio (0,50 g, 6,0 mmol) em ácido acético glacial (20 ml) em um balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a mistura a 120 ° c durante 6 h.
- Após o resfriamento, despeje a mistura roxa em H2o (100 ml) e mexa por 10 min. colete o sólido formado por filtração, lave com h2o (3 × 5 ml) e éter de petróleo (3 × 5 ml) e seque em vacuo.
- Preparação de 4-fluoro-2-(1-metil-2, 6-dioxopiperidina-3-yl) Isoindolina-1,3-diona (composto 4)
- Combine 3-fluorophthalic anidrido (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimida 2 (1,21 g, 5 mmol) e uma solução de acetato de sódio (0,50 g, 6,0 mmol) em ácido acético glacial (20 ml) em um balão de fundo redondo de 100 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a mistura a 120 ° c durante 6 h.
- Após o resfriamento, despeje a mistura roxa em H2o (100 ml) e mexa por 10 min. colete o sólido formado por filtração, lave com h2o (3 × 5 ml) e éter de petróleo (3 × 5 ml) e seque em vacuo.
- Preparação de tert-butil N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] etoxi] etoxi] etil] carbamato (composto 7)
- Carregue um balão de fundo redondo de 50 mL com tert-butil N-[2-[2-(2-aminoetoxi) etoxi] etil] carbamato (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composto 3 (0,41 g, 1,50 mmol), Dmf seco (10 ml) e dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Equipar com uma barra de agitação e um condensador de refluxo. Calor atmosfera de argônio a 90 ° c por 10 h.
- Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml), seque sobre na2so4, filtre e concentre-se em vacuo.
- Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 60 cm) usando um inclinação do éter do petróleo/EtOAc (1:1 a 1:2).
- Preparação de homodímero (composto 8)
- Combine o vinculador α, ω-diamina 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1, 5 ml, 6, 0 mmol) e uma solução de 3 (0,83 g, 3, 0 MMOL) em DMSO seco (20 ml) em um balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a atmosfera do argônio em 90 ° c por 18 h.
- Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml), seque sobre na2assim4, filtre e concentre-se em vacuo.
- Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 50 cm) usando um inclinação do éter/EtOAc do petróleo (1:2) ao EtOAc.
- Preparação de heterodímero (composto 9)
- Dissolver o composto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) em ch seco2CL2 (10 ml). Adicionar ácido trifluoroacético (10 mL) e agitar a mistura amarela a 40 ° c durante 2 h num balão fechado de 50 mL de fundo redondo.
- Retire os voláteis e coevate com CH2CL2 (4x 5 ml). Seque o resíduo em vacuo por 10 h.
- Redissolva o material em DMF seco (20 mL). Adicionar composto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) e dipea (0,78 g, 1, 5 mL, 6, 0 mmol) e equipar o balão com um condensador de refluxo. Calor atmosfera de argônio a 90 ° c por 10 h.
- Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com NaHCO saturado3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), H2o (50 mL), e salmoura (50 ml), seque sobre na2so4, filtre e concentre-se em vacuo.
- Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 50 cm) usando um inclinação do éter/EtOAc do petróleo (1:2) ao EtOAc.
- Elucidar e verificar a estrutura da molécula (Figura 5a composto 8, 5b composto 9) por 1H RMN e 13C NMR espectros em DMSO-d6 em uma ressonância magnética nuclear (RMN) Espectrômetro. Verifique se a pureza de ambos os compostos é superior a 97% por meio de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS), aplicando uma detecção de matriz de diodos (DAD) a 220 – 500 nm.
2. validação funcional de moléculas PROTAC
- Análise do borrão ocidental da degradação de CRBN por PROTACs
Nota: os efeitos do composto8e composto9no nível da proteína de CRBN foram testados pela análise ocidental do borrão. Além disso, o impacto nos níveis de IKZF1 e IKZF3 também pode ser confirmado (A Figura 6).-
Preparação da amostra
- Dissolva os compostos 8 e 9, lenalidomida (Len), Pomalidomida (POM), MG132, e mln-4924 no DMSO em uma concentração de 10 mm, alíquota e armazene a-80 ° c até o uso mais adicional.
- Semente 1 x 106 MM1S células em uma placa de 6 poços com 2,5 ml de mídia e tratar células com 100 nm ou 1 μm composto 8 ou 9 para 24 h.
- Colha pilhas após o tratamento e centrifugue em 700 x g, 5 min, 4 ° c. Lave a pelota da pilha com o frio 1X PBS para remover os meios restantes, centrifugador em 700 x g, 5 min, 4 ° c, e descarte o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
- Células de lyse em tampão de lise (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x protease & inibidor da fosfatase cocktail) por 10 min no gelo, centrífuga em 320 x g por 10 min, 4 ° c. Sobrenadante da colheita e determine a concentração da proteína por um ensaio ácido ácido da proteína (ensaio de BCA) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Proteínas de desnaturamento (15 – 30 μg/amostra) com tampão de carga de 1x LDS (5% 2-Mercaptoetanol) e ferver 10 min, 75 ° c.
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SDS-PÁGINA
- Fixe o sanduíche do gel com um gel de separação de 10% [tampão do gel de 4 mL 3x (Tris/HCl de 3 M, 0,3% (p/v) dodecilsulfato de sódio (SDS), pH 8,45), 4 mL de acrilamida 30%, 2,52 mL de glicerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% persulfato de amônio (APS) e 9,75 ΜL de TEMED] e um gel de empilhamento de 4% [1,992 mL 3x tampão de gel, 0,792 mL 30% acrilamida, 3,168 mL H2O, 36 μl 11% APS e 6 ΜL de TEMED] numa unidade de montagem de eléctrodos. Remover pentes, poços nivelado com tampão de cátodos (100 milímetros Tris/HCl, Tricine de 100 milímetros, 0,1% (w/v) SDS), e amostras da carga.
- Encha o tampão do ânodo (100 milímetros Tris/HCl, pH 8,9) no tanque. Carregue a amostra da proteína da etapa 2.1.1.4 e funcione SDS-PAGE em 70 V, 20 minutos, seguidos por 115 V, 150 minutos na tensão constante.
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Immunoblotting e deteção de CRBN, de IKZF1 e de IKZF3
- Ativar membrana de PVDF (0,45 μm) em 100% metanol por 1 min. equilibrar a membrana e separar O gel em 1x tampão de transferência [10x tampão de transferência (192 mM glicina, 25 mM TRIS-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
- Monte a gaveta blotting de acordo com o protocolo do fabricante. Gel de transferência em 180 mA por 90 min.
- Membrana de lavagem 3x em 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) por 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Membrana do bloco no leite nonfat-dried de 5% (NFDM), TBS-T para 1 h na temperatura ambiente. Lave a membrana 3x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente.
- Incubar a membrana com anticorpo preliminar para CRBN (1:500 em 5% BSA, TBS-T) com agitação delicada em 4 ° c, durante a noite.
- Lave a membrana 3x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Incubar membrana com anti-mouse (1:10.000 em 5% NFDM, TBS-T) ou anti-coelho (1:5.000 em 5% NFDM, TBS-T) anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano HRP (1 h à temperatura ambiente.)
- Lave a membrana 2x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Repita este passo duas vezes com 1x TBS.
- Incubar a membrana por 2 min com solução de substrato HRP de acordo com os protocolos do fabricante e detecte quimioluminescência em um dispositivo de detecção de quimioluminescência.
- Lave a membrana 1x em 1X TBS por 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Para a liberação de anticorpos, descasque a membrana no amortecedor de descascamento disponível comercialmente por 15 minutos. Lave a membrana 3x em 1X TBS por 5 – 10 minutos cada na temperatura ambiente.
- Reblock a membrana no leite nonfat-dried de 5%, TBS-T para 1 h na temperatura ambiente. Lave a membrana 3x em 1x TBS-T para 5 – 10 min cada em temperatura ambiente e resonda com IKZF1, IKZF3 ou tubulina de acordo com a etapa 2.1.3.4.
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Preparação da amostra
- Experimentos de competição com MG132, MLN4942 ou pomalidomida
Nota: para confirmar se a crbn é degradada através da via ubiquitina-Proteassoma, realizamos experimentos de competição com o inibidor do Proteassoma MG132 e um inibidor da enzima ativadora de Cullin (NAE) MLN4942 (Figura 7).- Semente 1 x 106 MM1S células por poço em uma placa de 6 poços. Pré-tratamento de células com 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, ou lenalidomida (100x), e incubar 1 h a 37 ° c, 5% CO2.
- Adicionar 100 nM composto 8 para 3 h a 37 ° c, 5% co2.
- Colha pilhas para o borrão ocidental de acordo com a etapa 2.1.1.
- Ensaios de viabilidade celular em linhas celulares de mieloma múltiplo
Nota: Este ensaio é utilizado para testar o impacto na viabilidade celular e, adicionalmente, antagonizar o efeito de IMiDs em células de mieloma múltiplo por pré-tratamento das células com composto 8 (Figura 8, Figura 9A, B).- Semente 5 x 104 MM1S Cells por bem em uma placa 96-well em triplica biológicos para o ensaio da viabilidade. Para a análise de Western blot, semente 1 x 106 MM1S células por poço em uma placa de 6 poços em triplicates biológicos.
- Trate as células com DMSO ou 100 nM, 1 μM ou 10 μM composto 8, composto 9 ou pomalidomida e incubar por 24 h, 48 h ou 96 h a 37 ° c, 5% co2. Para experimentos de resgate, trate células com 100 nM composto 8 para 3 h, antes ou depois da adição de 1 μm de pomalidomida e incubar por 96 h.
- Medida 96-bem luminescência da placa com um ensaio luminescentes da viabilidade da pilha, de acordo com o protocolo do fabricante em um leitor da placa ou pilhas da colheita da placa 6-well para a análise ocidental do borrão.
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Representative Results
Aqui nós descrevemos o projeto, a síntese e a avaliação biológica de um ProTac bacteriana do pomalidomide-baseado para a degradação de CRBN. Nosso ProTac interage simultaneamente com duas moléculas de crbn e forma complexos ternários que induz a degradação de autoubiquitinação e degradação de crbn com apenas efeitos remanescentes mínimos sobre os neosubstratos induzidos por pomalidomida IKZF1 ou IKZF3.
De uma série de moléculas PROTAC com base em pomalidomida previamente publicadas24, o composto 8 foi particularmente eficiente na degradação induzida por produtos químicos da CRBN. Sua síntese pode ser realizada da seguinte forma (Figura 4). Uma condensação 1, 1 '-carbonyldiimidazole-promovida da l-glutamina COB-protegida conduz ao imida ciclalizado 1. O analógico N-metilado 2 é acessível através de alquilação com iodeto de metilo. Ambos os blocos de construção (1 e 2) são transformados, após N-deprotection condições ácidas, aos derivados do ftalimida (3 e 4) no curso de uma reação da anel-abertura/recyclization usando 3- anidrido fluorophthalic. Os análogos da talidomida, em geral, são suscetíveis à decomposição hidrolítica e só devem ser utilizados na próxima etapa após uma secagem suficiente. O composto 3 é suscetível a uma substituição nucleofílica aromática com aminas alifáticas primárias25; Esta conversão foi encontrada para prosseguir eficientemente somente quando os solventes secos são usados. O design de um produto bacteriana verdadeiro implica a conexão do vinculador de duas subestruturas funcionais idênticas e a aplicação do vinculador simétrico. O vinculador que faz parte do PROTAC 8 representa uma cadeia linear de nan, com base em polietileno. O α, ω-diamine 6 correspondente conduz ao composto final desejado 8 quando reagido com bloco de construção 3 na ração do molar de 1:2 no DMSO em 90 ° c. Entre outros dados analíticos24, a estrutura de 8 foi verificada por RMN espectros (Figura 5a). Composto 9, projetado como um controle negativo adequado, tem um único mínimo, mas desvios estruturais críticos, em comparação com o ativo Homo-ProTac 8. Sabe-se que a N-metilação dentro da porção glutarimida abole a ligação de crbn26,27. Uma porção de pomalidomida do composto de controle negativo 9 carrega um resíduo de N-metil. Ele pode ser preparado por uma primeira substituição nucleofílica de 3 com o bloco de construção de vinculador N-monoprotected 5, seguido por clivagem do grupo de proteção do BOC e um acoplamento subsequente ao intermediário 4. Devido à sua estrutura assimétrica, alguns dos carbonos correspondentes mostraram sinais distintos de RMN de 13C (Figura 5b).
O Homo-ProTac 8 foi observado para ser altamente potente, levando a uma degradação degradação quase completa de CRBN. A interpretação dos níveis de proteína CRBN, IKZF1 e IKZF3 em células de mieloma múltiplo foi confirmada pela análise de Western blot (figura6, figura 7, Figura 9B), um método padrão semiquantitativo, onde a mudança de proteína expressão pode ser detectada facilmente. Os anticorpos usados neste papel são da boa qualidade e o método é um procedimento padrão aperfeiçoado em nosso laboratório.
Além disso, a degradação da CRBN pelo composto 8 não afetou a viabilidade celular e conferiu resistência a imids (Figura 8, Figura 9A), que está em consonância com nocaute de crbn , mediado por Crispr/Cas9, por sgrnas24. O sinal da luminescência no ensaio da viabilidade da pilha foi baseado na liberação do ATP, que pode ser interpretada como a contagem inoperante da pilha. Este método pode ser facilmente realizado em um curto espaço de tempo com um número elevado de amostras. Um método alternativo para a medida de pilhas viáveis/inoperantes é um Anexin V/7-AAD que mancha pelo fluxo cytometry.
Figura 1: a ligase de ubiquitina E3 CRBN é o principal alvo dos IMiDs. As drogas immunomodulatory ligam a crbn e recrutam diversos neo-substratos para a degradação degradação. A degradação Imid-induzida dos fatores lymphoid da transcrição IKZF1 e IKZF3 é responsável para os efeitos em pilhas múltiplas do mieloma e algumas das propriedades imunomoduladores. A caseína quinase 1 α é seletivamente degradada pela lenalidomida, mas não pelos outros IMiDs e contribui para a atividade da lenalidomida na síndrome mielodisplásica com perda do cromossomo 5q. SALL4 foi descoberto recentemente como um alvo comum de todos os imids que é provavelmente lig ao teratogenicidade induzido pelo talidomida e por seus Analogs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Protacs degradam a proteína de interesse (POI). Os PROTACs são moléculas heterobifuncionais, onde um linker conecta um ligase da oniquitina a um ligador de POI. Pela formação de complexos ternários, uma ligase ubiquitina, como a crbn, então ubiquitinates o POI, resultando em sua degradação degradação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Homo-PROTAC bifuncional para a degradação da ubiquitina ligase CRBN da E3. Em um Homo-PROTAC pomalidomida-baseado, dois aglutinantes da ligase do ubiquitin são conectados para induzir o Cross-ubiquitination de CRBN tendo por resultado um knockdown quimicamente induzido de CRBN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: síntese de homodímero 8 e heterodímero 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: 1H NMR (Top) e 13C NMR (bottom) espectros. Os espectros do composto 8 (A) e do composto 9 (B) foram registrados no DMSO-d6 em um espectrómetro de RMN. As mudanças químicas são dadas em partes por milhão (ppm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: efeitos dos compostos 8 e 9 no CRBN, IKZF1 e IKZF3. O composto de Homo-PROTAC com base em pomalidomida 8 induz a degradação da crbn com efeitos remanescentes fracos da pomalidomida em IKZF1 e IKZF3. Em contrapartida, o composto 9 que contém um grupo metilo em um dos resíduos de pomalidomida não tem efeito nas concentrações indicadas (μm). As pilhas MM1S foram tratadas para o tratamento 24 h. Os efeitos na CRBN, IKZF1, IKZF3 e tubulina (controle de carga) foram analisados por Western Blot. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: a degradação da crbn pode ser bloqueada pelo inibidor do Proteassoma MG132 ou por MLN4942 que bloqueia a ubiquitina ligases indiretamente através da inibição do cullin. A linhagem celular de mieloma múltiplo MM1s foi pré-tratada com 10 μM MG132,10 μM MLN4924 por 1 h antes da adição do composto Homo-PROTAC 8 a 100 nm por 3 h de tratamento combinado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Ensaio da viabilidade da pilha em pilhas múltiplas do mieloma MM1S. Efeitos do composto 8 e do composto de controle de ligação negativa 9 na viabilidade celular na linha celular de mieloma sensível à POMALIDOMIDA MM1S após 24 h, 48 h e 96 h de tratamento. A viabilidade celular foi mensurada após 4 dias em triplicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: O composto 8 antagoniza o efeito da pomalidomida em linhagens celulares de mieloma múltiplo. As pilhas foram pré-tratadas com o composto 8 de 100 nanômetro para 3 h. mais tarde a pomalidomida de 1 μm foi adicionada. A viabilidade celular foi mensurada após 4 dias em triplicados. p <0, 1 de acordo com o teste t de Student (a). Análise de Western blot para CRBN, IKZF1, IKZF3 e tubulina (controle de carga) após pré-tratamento de células MM1S com composto de 100 nM 8 para 3 h, antes da adição de 1 μm de Pomalidomida (B). Reprinted (adaptado) com permissão de Steinebach, C. et al. 201824. Copyright 2019 sociedade química americana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O projeto de tais Homo-protacs como descrito aqui para crbn confia na afinidade específica do pomalidomida ao crbn, que foi utilizado com sucesso em protacs heterobifunctional numerosos e conduziu ao desenvolvimento de ProTac 8 como altamente degradador seletivo de CRBN. A especificidade de nossa molécula já foi confirmada por análises proteômicas24. Para nocaute geneticamente negociado, exclusão e validação de efeitos colaterais é desafiador e demorado. Além disso, um knockdown quimicamente induzido é reversível, rápido e diretamente aplicável a um amplo espectro de células e tipos de tecido28.
Os imids thalidomide, lenalidomide, e pomalidomida tornaram-se um esteio no tratamento do myeloma múltiplo, dos linfomas da B-pilha e da síndrome myelodysplastic. Os imids mediam sua atividade modulando a especificidade da ligase crbn-CRL4 E3 para degradar os neosubstratos IKZF1, IKZF3, ou CK1α6,11,29. Além, os imids foram mostrados para revogar a função do acompanhante de crbn em duas outras proteínas, MCT-1 e BSG, que são igualmente importantes para o crescimento múltiplo do mieloma30. A degradação de crbn pelo ProTac Homo-bifunctional foi tolerada bem por a maioria de linhas de pilha do mieloma múltiplo testadas, implicando que a inactivação de crbn sozinho não é suficiente para causar a matança de pilhas múltiplas do mieloma. Em contraste, o pré-tratamento com o composto 8 revogada os efeitos dos imids na degradação IKZF1/3 e nas pilhas múltiplas resgatadas do mieloma do lenalidomida e do pomalidomide. Isto está na linha da inactivação genética de crbn e de mutações deletérias do crbn encontradas em pacientes múltiplos lenalidomide-resistentes do mieloma e destaca o papel essencial do crbn no mecanismo dos imids31,32 . O Homo-PROTAC 8 pode, portanto, ser uma ferramenta útil para imitar um estado de resistência Imid. Outros efeitos de IMiDs que não são totalmente compreendidos ainda como a inibição da angiogenicidade ou liberação TNFα pode derivar de uma inibição da função CRBN e nosso Homo-PROTAC são ferramentas adequadas para investigar a inactivação de CRBN ainda mais. Além disso, o knockdown quimicamente induzido de CRBN pelo composto 8 pode ajudar a identificar novos substratos endógenos de crbn e elucidar as funções fisiológicas da CRBN. Dado que nosso composto 8 não teve nenhum efeito na proliferação da linha celular do cancro, a inibição de crbn sozinho não tem nenhuma atividade antitumoral. No entanto, os degradadores da CRBN podem ser clinicamente aplicáveis em outras doenças que não o cancro. Nesse sentido, a inativação da crbn foi recentemente mostrada para conferir resistência à sepse e prevenir a obesidade induzida por dietas de alto teor de gordura em camundongos 33,34,35.
Em conclusão, nós geramos e validamos o primeiro inibidor químico de CRBN que pode servir como uma ferramenta útil para futuras investigações biomédicas sobre sinalização relacionada a CRBN e mecanismo molecular de talidomida e seus análogos.
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Disclosures
Os autores não declaram um potencial conflito financeiro de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 e SFB-1074 para J.K.; FOR2372 para a)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
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