意识大鼠肾血流量的长期连续测量

Summary

本协议描述了意识大鼠肾血流量的长期连续测量，并同时用植入的导管（充满液体或通过遥测）记录血压。

Abstract

肾脏在维持体液稳态方面起着至关重要的作用。肾血流量（RBF）的调节对于肾功能过滤和代谢的重要功能至关重要。已经在麻醉动物中进行了许多急性研究，以在各种条件下测量RBF，以确定负责调节肾脏灌注的机制。然而，由于技术原因，不可能在长时间内连续（24小时/天）测量无约束的未麻醉大鼠RBF。这些方法允许在数周内连续测定RBF，同时还使用植入导管（充满液体或通过遥测）记录血压（BP）。RBF监测是将大鼠放置在圆形伺服控制的鼠笼中进行的，该笼子使大鼠在整个研究中不受限制地移动。同时，防止来自流动探头和动脉导管的电缆缠结。首先在左肾动脉上放置超声流动探针，并在右股动脉中植入动脉导管，对大鼠进行仪器化。它们通过皮下输送到颈背，并分别连接到流量计和压力传感器以测量RBF和BP。手术植入后，立即将大鼠放入笼中恢复至少一周并稳定超声探头记录。尿液收集在该系统中也是可行的。该协议演示了用于连续监测的手术和手术后程序。

Introduction

肾脏仅占体重的0.5%，但血流量丰富，占总心输出量的20%-25%¹。肾血流量 （RBF） 的调节对肾功能、体液和电解质稳态至关重要。单侧肾切除^术后剩余肾脏中RBF的大幅^{增加以及肾衰竭中}RBF的减少很好地说明了血流调节对肾脏的重要性5，^6，7。RBF的这种变化是由于肾功能的改变还是由于RBF减少而导致的功能下降而发生的，在麻醉手术准备的动物或人类受试者中一直难以确定。需要进行时间研究，其中可以在定义的变化之前和之后确定事件，并在事件进展期间在同一只动物中观察到事件。在动物和人类研究中，RBF是通过对氨基马尿酸（PAH^）的清除率间接估计的8，9，10，最近通过超声⁹，11，12，MRI⁴，13和PET-CT^14，15等成像技术间接估计的。 它提供了每个肾脏的有用快照图像，并且可以跟踪疾病的进展。在没有麻醉的情况下通过超声或MRI扫描评估小动物的RBF具有挑战性。在同一只大鼠的意识条件下长时间连续测量RBF是不可能的。

因此，本协议开发了能够同时连续24小时/天测量RBF的技术，该技术已与自由移动的大鼠的连续血压测量方法相结合，如前所述¹⁶，¹⁷，¹⁸，¹⁹，^20，21.该技术允许对各种大鼠模型中的RBF进行时间评估，以研究未来各种肾脏疾病的因果关系。

Protocol

该协议由威斯康星州医学院机构动物护理和使用批准。达尔盐敏感大鼠（雄性和雌性），~8周龄，200-350g，用于实验。

1. 动物制备

1. 在动物室中为大鼠安装运动反应笼系统，血管周围流量模块，注射泵，记录装置和软件（见 材料表）。
2. 至少在手术前一周将大鼠放入笼子中以熟悉环境、食物和水系统。从手术前一天开始禁食大鼠，因为高胃含量可能会干扰流动探头进入左肾动脉并可能导致气管抽吸。
3. 用PVC水泥将5厘米的聚氨酯管（内径0.30毫米，外径0.64毫米）连接到90厘米聚氨酯管（内径0.64毫米和外径1.02毫米）的末端，以制作股动脉导管（见 材料表）。
   1. 用环氧乙烷灭菌器对导管进行灭菌，用2.5%戊二醛对流动探头进行灭菌，并在蒸汽高压灭菌器中对手术器械进行灭菌。用 1% 次氯酸钠擦拭手术台、显微镜检查和灯。

2. 手术

1. 按照以下步骤放置 RBF 探头。
   1. 用2.0%-2.5%异氟醚麻醉大鼠，使大鼠对疼痛刺激无反应。将其放在37°C的手术台上，并在手术前注射0.09mg / kg丁丙诺啡SR和15mg / kg头孢唑啉（见 材料表）。
   2. 用电动剪剃掉整个腹部，并在颈背上的第 7^颈 椎周围有一个区域，导管和血流证明电线将在那里退出。
   3. 剃须后，用70%乙醇，10%聚维酮碘擦拭该区域，然后再次用70%乙醇擦拭该区域。
   4. 将大鼠置于俯卧位。用手术刀在颈背和左胁上切开 1 厘米。然后，用止血钳进行钝性解剖，并清除从侧腹切口到颈部后部的皮下空间。
   5. 用止血钳将流动探头从颈部穿过皮下隧道到侧腹切口。
   6. 将大鼠置于仰卧位。做一个4-5厘米的中线腹部切口。
   7. 用弯曲的镊子解剖肾动脉周围的区域，以露出足以放置流动探头的空间（ 材料表）。然后用止血钳钝刺穿左腰四方肌，将流探头头拉入腹腔。
   8. 将流量探头的尖端钩到左肾动脉并将其连接到流量计（见 材料表）。在探头尖端周围添加一些凝胶，流量值将出现在流量计上。
      注意：虽然这取决于大鼠的大小，但在230克大鼠中将观察到约3-5mL / min的流量。
   9. 用组织粘合剂将附着在探头上的聚酯纤维网粘在腹壁上，并保持直到干燥并粘合（~1-2分钟）。流量到位后，断开流量探头与流量计的连接，用盐水浸泡的纱布覆盖腹部，然后继续插入导管的步骤。
2. 按照以下步骤插入股骨导管。
   注意：插入充满液体的导管的方法与常规遥测安装相同。虽然遥测是首选，但动脉导管可以对有意识的大鼠进行压力监测和定期血液采样。
   1. 首先，用生理盐水填充导管并用血管钳夹住它，然后使用左大腿上的手术刀做一个 1 cm 的皮肤切口，以解剖并暴露股动脉。在用线阻断股动脉近端的流动时，插入导管。
   2. 用少量生理盐水冲洗，用适当尺寸的不锈钢丝塞住，用线系好导管固定。
   3. 一旦结扎在导管周围，使用从大腿到颈部后部的不锈钢穿刺器将导管带到颈部区域，从而形成皮下隧道。用放置在斜方肌中的 3-0 丝线固定它。
3. 缝合探头。
   1. 将大鼠转向俯卧位，并在侧面皮下缝合流动探头的圆形环。用4-0手术缝合缝合侧腹和颈部的切口（见 材料表）。
   2. 将皮肤按钮连接到流动探头上，并在颈部后部用 3-0 丝缝合。
   3. 再次将流量探头连接到流量计，将大鼠转回背部位置以检查RBF，并对流量探头进行最终调整以优化其在肾动脉上的位置。
   4. 最后，用 3-0 丝缝合肌肉，用 4-0 手术缝合皮肤。

3. 动物的恢复

1. 仔细观察后，直到大鼠从麻醉中完全恢复，将大鼠放回运动反应笼系统，将流量探头连接到血流量计，并允许大约一周的恢复期以稳定探头和流量测量。
   注意：在此期间不必进行录制。
2. 在整个研究过程中，从动脉导管以 100 μL/h 的速度连续注入 3% 肝素化盐水，以防止凝血。
3. 当流量在5-6天后稳定下来时，将流量计校准设置为以0-20mL / min测量血流量，并开始连续记录RBF。

Representative Results

显示了来自代表性雄性达尔盐敏感大鼠的平均动脉压数据（图1A）和血流数据（图1B）。达尔盐敏感大鼠被维持在一个群体中，并在威斯康星医学院繁殖。手术在8周龄时完成，手术时体重为249克。给大鼠喂食0.4%NaCl饮食，并在10周龄时将饮食改为4%NaCl饮食。在4%NaCl饮食下继续测量3周，实验在13周龄时终止。数据以分钟平均值显示。在平均动脉压和血流量方面观察到明显的昼夜差异。虽然高血压随着高盐饮食而升高，但血流量趋于减少而不是增加，表明肾血管阻力增加。

图1：代表性动脉压和血流数据。 平均动脉压 （mm Hg） （A） 和肾血流量 （mL/min） （B） 以分钟平均值显示。LS：低盐（0.4%NaCl）饮食，HS：高盐（4%NaCl）饮食。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

本协议描述了一种利用市售仪器在数周内连续记录RBF和动脉压的技术。此外，可以使用步骤1.1中描述的装置收集尿液。它还可用于评估尿液中的代谢物，并在植入动脉导管时评估血液采样以进行分析。

传统上，RBF测量值已在手术制备的麻醉动物中急性获得或通过PAH清除率估计。然而，已经表明，各种麻醉剂^{和手术22，23}会改变肾血流量和动脉压。人类研究报告称，异氟醚将PAH清除率分别从476.8-243.3毫升/分钟和菊粉清除率从88.0降低到55.7毫升/^分钟8。硫巴比妥是一种麻醉剂，广泛用于大鼠的批判性研究。尽管如此，据报道，在用硫巴比妥²⁴麻醉后90分钟，肾皮质线粒体中的H₂O₂产生增加，这可能会影响血流。对于许多实验研究来说，在未麻醉和无应激的动物中进行测量将更加可取。通过植入流动探针来测量RBF的方法已在狗²⁵和大鼠²⁶中得到证明。这项工作还建立了一种在实验室中测量大鼠RBF的方法。

应用本演示文稿中描述的技术可以解决与给定刺激后的顺序事件相关的许多问题。未麻醉的仪器化大鼠模型能够确定对药物的即时和慢性反应以及高血压发展过程中可能发生的各种刺激的长期后果。

该手术涉及最小的失血，通过一些培训，存活率接近 100%。流动探头在用含有蛋白酶的阴离子洗涤剂洗涤并在4周实验后灭菌后可以重复使用。但是，塑料涂层会逐渐变质，并且在多次使用后需要维修。导管出口处的下一个皮肤按钮代表了最重要的潜在问题，因为如果不仔细清洁和消毒，它很容易受到感染、刺激和抓挠。但是，如果它变得松动，它可以在麻醉下快速修复。

手术的关键步骤是手术，掌握该技术可能需要一段时间。然而，一旦实现，非麻醉的慢性研究可以有效地进行，问题最少。无论菌株或性别如何，都可以对200-350g的大鼠进行手术。使用制造商已经准备的不同尺寸的流动探头也可以对不同大小的大鼠和动物进行实验。

但是，必须注意一些局限性和具体问题。首先，必须尽可能使用无菌器械、导管和流动探头进行手术，以尽量减少术后感染。其次，由于手术范围广泛，需要一个多小时，因此在获得研究的“对照”测量值之前，必须提供足够长的恢复期。我们实验室的这段时间通常为7-10天。第三，肠梗阻（肠道阻塞或麻痹）在某些情况下是一个问题，代表术后并发症。这可以通过避免在手术过程中暴露肠道（例如，用湿纱布包裹）并避免关闭腹部切口直到粘合充分干燥来预防。在手术过程中避免肠道暴露于肾动脉并确保缝合时肠道不会扭曲至关重要。第四，应该认识到RBF会随着肾脏重量的增加而成比例地增加。在切除对侧肾脏后发生肾肥大的研究中，必须考虑这一点。第五，我们只有长达一个月的RBF测量经验，并且没有尝试将测量时间延长到这段时间之外。由于在此期间几乎所有病例都进展顺利，因此研究可能会延长数周。最后，简要介绍一下平行动脉压测量：使用植入的充满液体的导管和稀释的肝素以保持24小时/天的通畅性和植入式遥测设备。每种都有优点和缺点，具体取决于实验设计和需求。例如，如果选择导管方法，则可以从动脉导管中抽血，并且遥测方法不需要肝素化。然而，在RBF和BP的长期测量中，两者都为我们提供了很好的帮助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software