Summary
El presente protocolo describe una medición continua a largo plazo del flujo sanguíneo renal en ratas conscientes y el registro simultáneo de la presión arterial con catéteres implantados (llenos de líquido o por telemetría).
Abstract
Los riñones juegan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de los fluidos corporales. La regulación del flujo sanguíneo renal (RBF) es esencial para las funciones vitales de filtración y metabolismo en la función renal. Se han llevado a cabo muchos estudios agudos en animales anestesiados para medir la RBF en diversas condiciones para determinar los mecanismos responsables de la regulación de la perfusión renal. Sin embargo, por razones técnicas, no ha sido posible medir RBF continuamente (24 h / día) en ratas no restringidas no anestesiadas durante períodos prolongados. Estos métodos permiten la determinación continua de RBF durante muchas semanas mientras que también registran simultáneamente la presión arterial (PA) con catéteres implantados (llenos de líquido o por telemetría). El monitoreo de RBF se lleva a cabo con ratas colocadas en una jaula circular servocontrolada para ratas que permite el movimiento sin restricciones de la rata durante todo el estudio. Al mismo tiempo, se evita el enredo de cables de la sonda de flujo y catéteres arteriales. Las ratas se instrumentan primero con una sonda de flujo ultrasónica colocada en la arteria renal izquierda y un catéter arterial implantado en la arteria femoral derecha. Estos se dirigen por vía subcutánea a la nuca y se conectan al medidor de flujo y al transductor de presión, respectivamente, para medir RBF y BP. Después de la implantación quirúrgica, las ratas se colocan inmediatamente en la jaula para recuperarse durante al menos una semana y estabilizar las grabaciones de la sonda ultrasónica. La recolección de orina también es factible en este sistema. Los procedimientos quirúrgicos y postquirúrgicos para el monitoreo continuo se demuestran en este protocolo.
Introduction
Los riñones son sólo el 0,5% del peso corporal pero ricos en flujo sanguíneo, recibiendo el 20%-25% del gasto cardíaco total1. La regulación del flujo sanguíneo renal (RBF) es fundamental para la función renal, los fluidos corporales y la homeostasis electrolítica. La importancia de la regulación del flujo sanguíneo para el riñón está muy bien ilustrada por el aumento sustancial de RBF en el riñón restante después de la nefrectomía unilateral 2,3,4 y por las reducciones de RBF que ocurren en la insuficiencia renal 5,6,7. Si tales cambios en RBF ocurren en respuesta a alteraciones en la función renal o una disminución en la función debido a la reducción de RBF ha sido difícil de determinar en animales anestesiados preparados quirúrgicamente o sujetos humanos. Se requieren estudios temporales en los que los eventos puedan determinarse antes y después de un cambio definido y observarse en el mismo animal durante la progresión de los eventos. En los estudios en animales y humanos, la RBF se ha estimado indirectamente por el aclaramiento del ácido para-amino hipúrico (HAP)8,9,10 y en tiempos más recientes por técnicas de imagen como ultrasonido9,11,12, MRI4,13 y PET-CT 14,15 que proporcionan imágenes instantáneas útiles de cada riñón y que pueden seguir la progresión de la enfermedad. Es difícil evaluar RBF en animales pequeños mediante ultrasonido o resonancias magnéticas sin anestesia. Ha sido imposible medir continuamente RBF en condiciones conscientes en la misma rata durante períodos prolongados.
El presente protocolo, por lo tanto, desarrolló técnicas que permiten mediciones simultáneas continuas de 24 h / día de RBF, que se ha combinado con métodos de medición continua de la presión arterial para ratas en movimiento libre como se describió anteriormente 16,17,18,19,20,21 . Esta tecnología permite la evaluación temporal de RBF en varios modelos de ratas para estudiar las relaciones causa-efecto en diversos trastornos renales en el futuro.
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Protocol
El protocolo está aprobado por el Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Para los experimentos se utilizaron ratas Dahl sensibles a la sal (machos y hembras), ~ 8 semanas de edad, 200-350 g.
1. Preparación de animales
- Instale un sistema de jaula de respuesta de movimiento para la rata, un módulo de flujo perivascular, una bomba de jeringa, un dispositivo de grabación y un software (consulte la Tabla de materiales) en la sala de animales.
- Coloque a las ratas en la jaula para familiarizarse con el medio ambiente, los alimentos y el sistema de agua al menos la semana anterior a la cirugía. Ayune las ratas desde el día anterior a la cirugía porque un alto contenido estomacal puede interferir con la colocación de la sonda de flujo en la arteria renal izquierda y puede causar aspiración traqueal.
- Conecte un tubo de poliuretano de 5 cm (diámetro interior 0,30 mm y diámetro exterior 0,64 mm) al extremo de los 90 cm de tubo de poliuretano (diámetro interior 0,64 mm y diámetro exterior 1,02 mm) con cemento PVC para hacer un catéter arterial femoral (ver Tabla de materiales).
- Esterilice los catéteres con un esterilizador de óxido de etileno, la sonda de flujo con glutaraldehído al 2,5% y los instrumentos quirúrgicos en un autoclave de vapor. Limpie las mesas quirúrgicas, la microscopía y las luces con hipoclorito de sodio al 1%.
2. Cirugía
- Coloque la sonda RBF siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Anestesiar a las ratas con 2.0% -2.5% de isoflurano en la medida en que las ratas no respondan al estímulo del dolor. Colóquelo en la mesa quirúrgica a 37 °C e inyecte 0,09 mg/kg de buprenorfina SR y 15 mg/kg de cefazolina (ver Tabla de materiales) antes de la cirugía.
- Afeite todo el abdomen con un cortapelos eléctrico y una región en la nuca alrededor de la7ª vértebra cervical donde el catéter y el flujo prueban que los cables saldrán.
- Después del afeitado, limpie el área con 70% de etanol, 10% de povidona yodada y nuevamente con 70% de etanol.
- Coloque la rata en posición prona. Hacer un corte de 1 cm con un bisturí en la nuca y el flanco izquierdo. Luego, realice una disección contundente con fórceps hemostáticos y despeje un espacio subcutáneo desde la incisión del flanco hasta la parte posterior del cuello.
- Pase la sonda de flujo a través de este túnel subcutáneo desde el cuello hasta la incisión del flanco con pinzas hemostáticas.
- Coloque la rata en posición supina. Haga una incisión abdominal de 4-5 cm en la línea media.
- Diseccionar el área alrededor de la arteria renal con pinzas curvas para exponer un espacio suficiente para colocar la sonda de flujo (consulte la Tabla de materiales). Luego, perfore sin rodeos el músculo cuadrado lumbar izquierdo con los fórceps hemostáticos y tire de la cabeza de la sonda de flujo hacia la cavidad abdominal.
- Enganche la punta de la sonda de flujo a la arteria renal izquierda y conéctela al medidor de flujo (consulte la Tabla de materiales). Agregue un poco de gel alrededor de la punta de la sonda y el valor del caudal aparecerá en el medidor de flujo.
NOTA: Aunque depende del tamaño de la rata, se observará un flujo de aproximadamente 3-5 ml / min en una rata de 230 g. - Pegue la malla de fibra de poliéster unida a la sonda con adhesivo tisular a la pared abdominal y manténgala hasta que esté seca y unida (~ 1-2 min). Una vez que el flujo esté en su lugar, desconecte la sonda de flujo del medidor de flujo y cubra el abdomen con una gasa empapada en solución salina y continúe con el paso de insertar el catéter.
- Inserte el catéter femoral siguiendo los pasos a continuación.
NOTA: El método para insertar un catéter lleno de líquido es el mismo que las instalaciones de telemetría normales. Aunque se prefiere la telemetría, el catéter arterial permite el monitoreo de la presión y el muestreo de sangre del período de la rata consciente.- Primero, llene el catéter con solución salina y sujete con fórceps vasculares antes de hacer una incisión de piel de 1 cm con un bisturí en el muslo izquierdo para diseccionar y exponer la arteria femoral. Mientras bloquea el flujo en el lado proximal de la arteria femoral con un hilo, inserte el catéter.
- Enjuague con una pequeña cantidad de solución salina, tape con alambre inoxidable del tamaño apropiado y ate el catéter con un hilo para fijarlo.
- Una vez que la ligadura esté atada alrededor del catéter, cree un túnel subcutáneo usando un trocar de acero inoxidable desde el muslo hasta la parte posterior del cuello para llevar el catéter a la región del cuello. Asegúrelo con suturas de seda 3-0 colocadas en el músculo trapecio.
- Sutura la sonda.
- Gire la rata a la posición prona y cose el bucle circular de la sonda de flujo por vía subcutánea en el flanco. Suturar la incisión en el flanco y el cuello con sutura quirúrgica 4-0 (ver Tabla de materiales).
- Coloque un botón de piel en la sonda de flujo y suture con seda 3-0 en la parte posterior del cuello.
- Conecte la sonda de flujo al medidor de flujo nuevamente, gire la rata a la posición dorsal para verificar RBF y realice los ajustes finales de la sonda de flujo para optimizar su posición en la arteria renal.
- Finalmente, suturar el músculo con seda 3-0 y la piel con sutura quirúrgica 4-0.
3. Recuperación del animal
- Después de una observación cuidadosa, hasta que las ratas estén completamente recuperadas de la anestesia, devuelva las ratas a un sistema de jaula de respuesta de movimiento, conecte la sonda de flujo al medidor de flujo sanguíneo y permita un período de recuperación de aproximadamente una semana para estabilizar la sonda y la medición del flujo.
NOTA: La grabación no tiene que hacerse durante este período. - Infundir solución salina heparinizada al 3% continuamente durante todo el estudio desde el catéter arterial a razón de 100 μL/h para prevenir la coagulación.
- Cuando el flujo se estabilice después de 5-6 días, configure la calibración del medidor de flujo para medir el flujo sanguíneo a 0-20 ml / min y comience el registro continuo de RBF.
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Representative Results
Se muestran los datos de presión arterial media (Figura 1A) y los datos de flujo sanguíneo (Figura 1B) de una rata Dahl sensible a la sal macho representativa. Las ratas Dahl sensibles a la sal se mantienen en una colonia y se crían en el Colegio Médico de Wisconsin. La cirugía se realizó a la edad de 8 semanas, y el peso corporal era de 249 g en el momento de la cirugía. Las ratas fueron alimentadas con una dieta de NaCl al 0,4%, y la dieta se cambió a una dieta de NaCl al 4% a la edad de 10 semanas. Las mediciones continuaron durante 3 semanas con una dieta de NaCl al 4%, y el experimento se terminó a las 13 semanas de edad. Los datos se muestran con un promedio de minutos. Se observó una clara diferencia diurna en la presión arterial media y el flujo sanguíneo. Mientras que la presión arterial aumenta con una dieta alta en sal, el flujo sanguíneo tiende a disminuir en lugar de aumentar, lo que sugiere una mayor resistencia vascular renal.
Figura 1: Datos representativos de presión arterial y flujo sanguíneo. La presión arterial media (mm Hg) (A) y el flujo sanguíneo renal (ml/min) (B) se muestran con un promedio minuto. LS: dieta baja en sal (0,4% NaCl), HS: dieta alta en sal (4% NaCl). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente protocolo describe una técnica que utiliza instrumentación disponible comercialmente para registrar RBF y presión arterial continuamente durante muchas semanas. Además, la orina se puede recoger utilizando el dispositivo descrito en el paso 1.1. También se puede utilizar para evaluar metabolitos en la orina y, cuando se implanta un catéter arterial, muestreo de sangre para su análisis.
Tradicionalmente, las mediciones de RBF se han obtenido de forma aguda en animales anestesiados preparados quirúrgicamente o estimados por aclaramiento de HAP. Sin embargo, se ha demostrado que diversos anestésicos y cirugías22,23 alteran el flujo sanguíneo renal y la presión arterial. Los estudios en humanos han informado que el isoflurano redujo el aclaramiento de HAP de 476,8-243,3 ml/min y el aclaramiento de inulina de 88,0 a 55,7 ml/min, respectivamente8. El tiobarbital es un anestésico que se usa ampliamente para estudios críticos de ratas. Aún así, se informa que la producción deH2O2en las mitocondrias de la corteza renal aumenta 90 min después de la anestesia con tiobarbital24, lo que podría afectar el flujo sanguíneo. Las mediciones en animales no anestesiados y no estresados serían mucho más preferibles para muchos estudios experimentales. El método de medición de RBF mediante la implantación de una sonda de flujo se ha demostrado en perros25 y ratas26. Este trabajo también ha establecido una forma de medir RBF en ratas en el laboratorio.
La aplicación de las técnicas descritas en esta presentación puede abordar muchas preguntas relacionadas con los eventos secuenciales después de un estímulo dado. El modelo de rata instrumentada no anestesiada permite la determinación de las respuestas inmediatas y crónicas a las consecuencias farmacológicas y a largo plazo de diversos estímulos que pueden ocurrir durante el desarrollo de la hipertensión.
La cirugía implica una pérdida mínima de sangre con tasas de supervivencia de casi el 100% con algo de entrenamiento. Las sondas de flujo se pueden reutilizar después del lavado con detergente aniónico contenido en proteasa y esterilización después de un experimento de 4 semanas. Sin embargo, el recubrimiento plástico se deteriorará gradualmente y, después de varios usos, requerirá reparación. El botón de piel en el siguiente donde salen los catéteres representa el problema potencial más importante, ya que es vulnerable a infecciones, irritación y arañazos si no se limpia y desinfecta cuidadosamente. Sin embargo, si esto se afloja, se puede reparar rápidamente bajo anestesia.
El paso crítico del procedimiento es la cirugía, y puede llevar un tiempo dominar la técnica. Sin embargo, una vez logrados, los estudios crónicos no anestesiados pueden llevarse a cabo productivamente con problemas mínimos. Es posible operar en ratas de 200-350 g independientemente de la cepa o el sexo. Los experimentos en ratas de diferentes tamaños y animales también son posibles utilizando sondas de flujo de diferentes tamaños ya preparadas por los fabricantes.
Sin embargo, hay limitaciones y cuestiones específicas a las que uno debe prestar atención. Primero, la cirugía debe realizarse utilizando instrumentos esterilizados, catéteres y sondas de flujo en la medida de lo posible para minimizar las infecciones posquirúrgicas. En segundo lugar, como la cirugía es extensa y requiere más de una hora, se debe proporcionar un período de recuperación suficientemente largo antes de obtener mediciones de "control" para el estudio. Este período en nuestro laboratorio generalmente se extiende de 7 a 10 días. En tercer lugar, el íleo (una oclusión o parálisis del intestino) ha sido un problema que en algunos casos representa una complicación postoperatoria. Esto se puede prevenir evitando la exposición del intestino (p. ej., mantener envuelto en una gasa húmeda) durante el procedimiento y evitando cerrar la incisión abdominal hasta que el enlace esté bien seco. Es esencial evitar exponer el intestino a la arteria renal durante la cirugía y asegurarse de que el intestino no se tuerza al suturar. En cuarto lugar, debe reconocerse que RBF aumentará proporcionalmente con el aumento del peso renal. Esto debe considerarse en estudios en los que se produce hipertrofia renal después de la extirpación del riñón contralateral. En quinto lugar, solo tenemos experiencia en la medición de RBF durante un máximo de un mes y no hemos intentado extender las mediciones más allá de este período. Dado que las cosas funcionaron bien durante este período en casi todos los casos, los estudios probablemente podrían extenderse muchas semanas después. Finalmente, unas breves palabras sobre las mediciones paralelas de la presión arterial: se utilizan los catéteres implantados llenos de líquido con heparina diluida para mantener la permeabilidad de 24 h / día y los dispositivos de telemetría implantados. Cada uno tiene ventajas y desventajas dependiendo del diseño experimental y las necesidades. Por ejemplo, es posible tomar muestras de sangre del catéter arterial si se elige el método del catéter, y no se requiere heparinización para el método de telemetría. Sin embargo, ambos nos han servido bien durante las mediciones a largo plazo de RBF y BP.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones para investigación científica (P01 HL116264, RO1 HL137748). Los autores desean agradecer a Theresa Kurth por sus consejos y ayuda para mantener el entorno experimental como gerente del laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
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