De Ex vivo Geïsoleerd Skeletal microvaatjes Voorbereiding Voor het onderzoek van vasculaire reactiviteit
Summary
Een<em> Ex vivo</em> Voorbereiding wordt beschreven voor het isoleren van de grootste gracilis spier weerstand arteriolen is voor raadpleging van zowel vasculaire reacties op vasoactieve stimuli en de beoordeling van de fundamentele structurele eigenschappen via passieve muur mechanica.
Abstract
De geïsoleerde microvaatjes voorbereiding is een ex vivo voorbereiding die het mogelijk maakt voor het onderzoek van de verschillende bijdragen van de factoren die de controle bloedvaten, en dus perfusie weerstand 1-5. Dit is een klassiek experimenteel preparaat dat, was in hoge mate, in eerste instantie beschreven door Uchida et al. 15. Enkele decennia geleden. Deze eerste beschrijving vormt de basis voor de technieken die op grote schaal werd gewijzigd en aangevuld, met name in het laboratorium van Dr Brian Duling aan de Universiteit van Virginia 6-8, en we presenteren een huidige aanpak op de volgende pagina's. Deze voorbereiding zal specifiek verwijzen naar de gracilis arteriole in een rat als het microvaatje van keuze, maar de basis bereiding gemakkelijk kan worden toegepast op schepen geïsoleerd van bijna elk ander weefsel of orgaan bij verschillende diersoorten 9-13. Mechanische (dat wil zeggen, dimensionaal) veranderingen in de geïsoleerde micro-vaatjes kan gemakkelijk worden geëvalueerdin antwoord op een breed scala van fysiologische (bijvoorbeeld hypoxie, intravasculaire druk of afschuiving) of farmacologische problemen en kan inzicht in mechanische elementen die geïntegreerd reacties in een intacte, maar ex vivo, weefsel. De betekenis van deze methode is dat het mogelijk maakt gemakkelijke manipulatie van de invloeden van de geïntegreerde regulering van diameter microvaatje, en daarbij tevens de controle van vele van de bijdragen van andere bronnen, zoals intravasculaire druk (myogene) autonome innervatie hemodynamische ( bijvoorbeeld, shear stress), endotheel afhankelijke of onafhankelijke stimuli, hormonale en parenchymale invloeden, om een deel van de lijst te verstrekken. Onder geschikte proefomstandigheden en met geschikte doelen kan dit als een voordeel ten opzichte in vivo of in situ weefsel / orgaan preparaten, die niet gemakkelijk mogelijk om de eenvoudige besturing van bredere systemische variabelen.
Het major beperking van dit preparaat in hoofdzaak het gevolg van de sterke. Per definitie is het gedrag van deze schepen wordt bestudeerd onder omstandigheden waar veel van de meest belangrijke mate bijdragen aan de regulering van vasculaire weerstand hebben afgeschaft, ook neurale, humorale, metabole, enz. Als zodanig wordt de onderzoeker gewaarschuwd om over-te voorkomen de interpretatie en de extrapolatie van de gegevens die worden verzameld gebruik te maken van deze voorbereiding. Het andere belangrijke punt van zorg met betrekking tot deze voorbereiding is dat het kan heel gemakkelijk om cellulaire componenten zoals de endotheliale bekleding of de vasculaire gladde spieren beschadigen, kunnen dergelijke die variabele bron van fouten worden ingevoerd. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat de individuele onderzoeker juiste metingen om de kwaliteit van de voorbereiding te garanderen gebruiken, zowel bij de start van het experiment en periodiek in de loop van een protocol.
Protocol
Discussion
De gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie, de verwijdering en dubbele cannulatie van een skeletspier microvaatje, hoewel dit algemene techniek gemakkelijk kan worden toegepast op de meeste weefsels. Voor de huidige manuscript, is de term "arteriole" is gebruikt door de auteurs op een weerstand schip variërend van 70 tot 120 micrometer in diameter onder rust actief toon, die ook een belangrijke bijdrage aan de regulering van perfusie weerstand tegen een orgaan of te beschrijven weefsel.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (EIA 0740129N) en NIH T32 HL90610.
Materials
| Reagents and Equipment | Company | Comments/Catalogue # |
| Vessel Chamber | Custom | Dave Eick (MCW) |
| Heated Circulating Water Bath | PolyScience and Haake | Haake DC 10 |
| Pipets | Frederick Haer & Co. | Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1) |
| Pressure Monitor | World Precision Instruments | |
| Water Jacketed Reservoir | Custom | |
| External Light Source | World Precision Instruments | Novaflex |
| Pipet Puller | MicroData Instruments | PMP102 Micropipet Puller |
| Full complement of surgical tools | Fine Science Tools | Dumont |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | Inox #5 |
| Silk Suture Thread | Ethilon | #10-0 or 9-0 |
| Stereo Microscope | Olympus | Olympus SZ-11 |
| Analog Video Calipers | Boeckeler | Via Controller (Via-100) |
| High Resolution Analog Camera | Panasonic | GP-MF 602 |
| Oxygen Tank | Regional | 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen |
| Tubing | Tygon | |
| Drain Pump | Cole Parmer Instrument Co. | |
| Modified Rat PSS | See recipe below | |
| Van Breemen’s Relaxant PSS | See recipe below |
Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.
| Modified Rat PSS Recipe | To make two liters of PSS | 20X Salt Stock (2L) | 20X Buffer Stock (2L) |
| NaCl | 278.0 g | ||
| KCl | 14.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 11.5 g | ||
| CaCl2-H2O | 9.4 g | ||
| NaHCO3 | 80.8 g | ||
| EDTA | 0.4 g | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.
Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.
| Van Breemen’s Relaxant PSS | To make 2 liters of PSS | 20X Salt Stock (1L) | 20X Buffer Stock (1L) |
| NaCl | 107.4 g | ||
| KCl | 7.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 5.76 g | ||
| MgCl2-6H2O | 81.32 g | ||
| NaHCO3 | 40.4 g | ||
| EDTA | 0.2 g | ||
| EGTA | 15.22 | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.
Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.
References
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
- Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
- LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
- Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
- Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
- Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d’Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
- Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
- Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. s. o. l. a. t. e. d., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. 32, 435-456 (1995).
- Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).
