O Ex vivo Preparação microvasos isolada esquelético de Investigação da reatividade vascular
Summary
Um<em> Ex vivo</emPreparação> é descrita para o isolamento das maiores grácil arteríolas musculares de resistência para interrogatório de ambas as respostas vasculares aos estímulos vasoativos e na avaliação de propriedades estruturais básicas via mecânica da parede passivos.
Abstract
A preparação de microvasos isolado é uma preparação ex vivo que permite a análise das diferentes contribuições de factores que o diâmetro dos vasos de controlo, e assim, a resistência de perfusão 1-5. Esta é uma preparação clássica experimental que foi, em grande medida, inicialmente descrita por Uchida et al. De 15 há várias décadas. Esta descrição inicial serviu de base para as técnicas que foi amplamente modificado e melhorado, principalmente no laboratório do Dr. Brian Duling da Universidade de Virginia 6-8, e nós apresentamos uma abordagem atual nas páginas seguintes. Esta preparação irá referir-se especificamente à arteríola gracilis num rato como o microvasos de escolha, mas a preparação de base pode facilmente ser aplicado aos recipientes isolados a partir de quase qualquer outro tecido ou órgão em várias espécies 9-13. Mecânico (ie, dimensional) alterações no microvasos isolado pode ser facilmente avaliadaem resposta a uma ampla gama de fisiológico embora ex (por exemplo, pressão, hipóxia intravascular, ou cisalhamento) ou desafios farmacológicos, e pode fornecer uma visão em elementos mecanicistas compreendendo respostas integrados em um intacto, in vivo de tecidos,. O significado deste método é que ele permite uma manipulação fácil das influências sobre a regulação integrado de diâmetro microvascular, enquanto também permite que para o controlo de muitas das contribuições a partir de outras fontes, incluindo a pressão intravascular (miogênica), inervação autonômica, hemodinâmica ( por exemplo, estresse, cisalhamento), disfunção endotelial, estímulos dependentes ou independentes, hormonais e influências parenquimatosas, para fornecer uma lista parcial. Sob condições experimentais adequadas e com metas apropriadas, este pode servir como uma vantagem sobre in vivo ou in situ de tecidos de órgãos / preparações, que não permitem prontamente para o controlo fácil do mais amplos variáveis sistémicas.
A malimitação jor desta preparação é essencialmente a conseqüência de suas forças. Por definição, o comportamento destes navios está sendo estudada sob condições em que muitos dos contribuintes mais significativos para a regulação da resistência vascular tenham sido removidos, incluindo neural, humoral, metabólicas, etc Como tal, o investigador deve ser advertido para evitar o excesso de interpretação e extrapolação dos dados que são coletados utilizando esta preparação. A outra área significativa de preocupação em relação a esta preparação é que ele pode ser muito fácil de danificar os componentes celulares, tais como o revestimento endotelial ou o músculo liso vascular, tal fonte que variável de erro pode ser introduzido. É fortemente recomendada que o investigador indivíduo utilizar medições adequadas para assegurar a qualidade da preparação, tanto no início da experiência e periodicamente durante todo o curso de um protocolo.
Protocol
Discussion
O protocolo apresentado descreve a canulação remoção de isolamento, e uma dupla de microvasos músculo esquelético, embora esta técnica geral, pode ser facilmente aplicada a maior parte dos tecidos. Para o manuscrito atual, o termo "arteríola" tem sido usado pelos autores para descrever um navio resistência variando entre 70-120 m de diâmetro em tom de descanso ativo, que é também um contributo importante para a regulação da resistência de perfusão de um órgão ou de tecido.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (EIA 0740129N) e T32 NIH HL90610.
Materials
| Reagents and Equipment | Company | Comments/Catalogue # |
| Vessel Chamber | Custom | Dave Eick (MCW) |
| Heated Circulating Water Bath | PolyScience and Haake | Haake DC 10 |
| Pipets | Frederick Haer & Co. | Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1) |
| Pressure Monitor | World Precision Instruments | |
| Water Jacketed Reservoir | Custom | |
| External Light Source | World Precision Instruments | Novaflex |
| Pipet Puller | MicroData Instruments | PMP102 Micropipet Puller |
| Full complement of surgical tools | Fine Science Tools | Dumont |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | Inox #5 |
| Silk Suture Thread | Ethilon | #10-0 or 9-0 |
| Stereo Microscope | Olympus | Olympus SZ-11 |
| Analog Video Calipers | Boeckeler | Via Controller (Via-100) |
| High Resolution Analog Camera | Panasonic | GP-MF 602 |
| Oxygen Tank | Regional | 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen |
| Tubing | Tygon | |
| Drain Pump | Cole Parmer Instrument Co. | |
| Modified Rat PSS | See recipe below | |
| Van Breemen’s Relaxant PSS | See recipe below |
Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.
| Modified Rat PSS Recipe | To make two liters of PSS | 20X Salt Stock (2L) | 20X Buffer Stock (2L) |
| NaCl | 278.0 g | ||
| KCl | 14.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 11.5 g | ||
| CaCl2-H2O | 9.4 g | ||
| NaHCO3 | 80.8 g | ||
| EDTA | 0.4 g | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.
Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.
| Van Breemen’s Relaxant PSS | To make 2 liters of PSS | 20X Salt Stock (1L) | 20X Buffer Stock (1L) |
| NaCl | 107.4 g | ||
| KCl | 7.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 5.76 g | ||
| MgCl2-6H2O | 81.32 g | ||
| NaHCO3 | 40.4 g | ||
| EDTA | 0.2 g | ||
| EGTA | 15.22 | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.
Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.
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