Summary

Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

Published: April 28, 2012
doi:

Summary

Ein<em> Ex vivo</em> Präparat wird zur Isolierung der größten M. gracilis Widerstand Arteriolen zur Vernehmung der beiden vaskulären Reaktionen auf vasoaktive Reize und die Bewertung der grundlegenden Eigenschaften über passive Wand Mechanik beschrieben.

Abstract

Die isolierte microvessel Vorbereitung ist eine Ex-vivo-Präparat, das zur Untersuchung der unterschiedlichen Beiträge der Faktoren, die Kontrolle Gefäßdurchmesser ermöglicht, und somit Perfusionswiderstandes 1-5. Dies ist ein klassisches experimentelles Präparat, das in hohem Maße war, zunächst von Uchida et al. 15 vor einigen Jahrzehnten. Diese erste Beschreibung, die die Grundlage für die Techniken, die umfassend modifiziert und verbessert wurde, in erster Linie im Labor von Dr. Brian Duling an der University of Virginia 6-8, und präsentieren wir Ihnen eine aktuelle Ansatz auf den folgenden Seiten. Diese Vorbereitung wird speziell auf die gracilis Arteriole in einer Ratte als microvessel der Wahl beziehen, aber die grundlegende Vorbereitung lässt sich problemlos auf Schiffe von nahezu jedem anderen Gewebe oder Organ über Artgrenzen 13.09 isoliert angewendet werden. Mechanische (dh dreidimensionale) Veränderungen in der isolierten Mikrogefäße kann leicht ausgewertet werdenin Reaktion auf eine breite Palette von physiologischen (zB Hypoxie, intravaskuläre Druck oder Scherung) oder pharmakologische Herausforderungen und einen Einblick in mechanistische Elemente mit integrierten Reaktionen in einer intakten bereitzustellen, obwohl ex vivo Gewebe. Die Bedeutung dieser Methode ist, dass es für einfache Manipulation der Einflüsse können auf der integrierten Regelung der microvessel Durchmesser, aber dabei auch für die Steuerung von vielen der Beiträge aus anderen Quellen, einschließlich der intravaskulären Druck (myogenen), autonomen Innervation, hämodynamische ( zB Scherspannung), Endothel-abhängigen oder unabhängigen Stimuli, hormonelle und Parenchymzellen Einflüsse, um eine teilweise Liste zu liefern. Unter geeigneten experimentellen Bedingungen und mit entsprechenden Zielen, kann dies als Vorteil gegenüber in vivo oder in situ Gewebe / Organ Präparate, die nicht leicht für die einfache Steuerung von größeren systemischen Variablen ermöglichen dienen.

Die major Einschränkung dieser Vorbereitung ist im Wesentlichen die Folge seiner Stärken. Per Definition ist das Verhalten dieser Schiffe wird unter Bedingungen, wo viele der bedeutendsten Beiträge zur Regulierung des vaskulären Widerstands entfernt worden sind, einschließlich der neuronalen, humoralen, metabolischen, etc. Als solche untersucht, so ist der Prüfer darauf achten, sich über-vermeiden Interpretation und Extrapolation der Daten, die gesammelt unter Verwendung dieser Zubereitung werden. Ein weiterer wichtiger Bereich der Bedenken hinsichtlich dieser Zubereitung ist, dass sie sehr einfach zu zellulären Bestandteilen wie das Endothel oder vaskulären glatten Muskelzellen beschädigen kann, so dass variable Quelle der Fehler eingeführt werden. Es wird dringend empfohlen, dass die einzelnen Ermittler entsprechende Messungen, um die Qualität der Zubereitung gewährleisten zu nutzen, sowohl auf der Start des Experiments und in regelmäßigen Abständen im Laufe eines Protokolls.

Protocol

1. Vor dem Experiment Vor dem Experiment Tag werden Glaskapillarrohre den passenden Abmessungen für die Station in Mikropipetten (entweder eine horizontale oder vertikale Abzieher kann verwendet werden) gezogen wird. Der Durchmesser der Spitze kann leicht eingestellt werden je nach Gefäß isoliert, obwohl wir verwenden in der Regel einen Durchmesser zwischen 50-150 um. Diese werden dann an die entsprechende Konfiguration für den microvessel Station folgenden Erwärmen über einer Flamme Butan gebogen. Mikr…

Discussion

Das Protokoll beschreibt die Isolierung dargestellt, Entfernen und Doppel-Kanülierung eines Skelettmuskels Mikrogefäßzellen, obwohl diese allgemeine Technik kann einfach in die meisten Gewebe aufgebracht werden. Für das laufende Manuskript hat der Begriff "Arteriole" von den Autoren verwendet worden, um einen Widerstand im Bereich zwischen 70-120 Schiff um Durchmesser unter Ruhebedingungen aktiven Ton, der auch ein wesentlicher Faktor für die Regulierung der Durchblutung Widerstand gegen ein Organ oder be…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (EIA 0740129N) und NIH T32 HL90610 unterstützt.

Materials

Reagents and Equipment Company Comments/Catalogue #
Vessel Chamber Custom Dave Eick (MCW)
Heated Circulating Water Bath PolyScience and Haake Haake DC 10
Pipets Frederick Haer & Co. Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1)
Pressure Monitor World Precision Instruments  
Water Jacketed Reservoir Custom  
External Light Source World Precision Instruments Novaflex
Pipet Puller MicroData Instruments PMP102 Micropipet Puller
Full complement of surgical tools Fine Science Tools Dumont
Ultra Fine Forceps Fine Science Tools Inox #5
Silk Suture Thread Ethilon #10-0 or 9-0
Stereo Microscope Olympus Olympus SZ-11
Analog Video Calipers Boeckeler Via Controller (Via-100)
High Resolution Analog Camera Panasonic GP-MF 602
Oxygen Tank Regional 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen
Tubing Tygon  
Drain Pump Cole Parmer Instrument Co.  
Modified Rat PSS See recipe below  
Van Breemen’s Relaxant PSS See recipe below  

Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.

Modified Rat PSS Recipe To make two liters of PSS 20X Salt Stock (2L) 20X Buffer Stock (2L)
NaCl   278.0 g  
KCl   14.0 g  
MgSO4-7H2O   11.5 g  
CaCl2-H2O   9.4 g  
NaHCO3     80.8 g
EDTA     0.4 g
NaH2PO4 0.28 g    
Glucose 1.98 g    
20x Salt Stock 100 mL    
20x Buffer Stock 100 mL    
Distilled Water 1800 mL    

Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.

Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.

Van Breemen’s Relaxant PSS To make 2 liters of PSS 20X Salt Stock (1L) 20X Buffer Stock (1L)
NaCl   107.4 g  
KCl   7.0 g  
MgSO4-7H2O   5.76 g  
MgCl2-6H2O   81.32 g  
NaHCO3     40.4 g
EDTA     0.2 g
EGTA     15.22
NaH2PO4 0.28 g    
Glucose 1.98 g    
20x Salt Stock 100 mL    
20x Buffer Stock 100 mL    
Distilled Water 1800 mL    

Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.

Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.

References

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Cite This Article
Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity. J. Vis. Exp. (62), e3674, doi:10.3791/3674 (2012).

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