Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare
Summary
Un<em> Ex vivo</emPreparazione> è descritto per l'isolamento delle arteriole muscolari più grandi di resistenza gracile per l'interrogatorio di entrambe le risposte vascolari a stimoli vasoattivi e la valutazione delle proprietà strutturali di base attraverso la meccanica della parete passivi.
Abstract
La preparazione dei microvasi isolato è un preparato ex vivo che consente l'esame dei contributi di diversi fattori che diametro natante di controllo, e quindi, la resistenza perfusione 1-5. Questa è una preparazione classica sperimentale che è stato, in larga misura, inizialmente descritto da Uchida et al 15. Diversi decenni fa. Questa descrizione iniziale fornito la base per le tecniche che è stato ampiamente modificato e ampliato, principalmente nel laboratorio del Dr. Brian Duling presso la University of Virginia 6-8, e presentiamo un approccio corrente nelle pagine seguenti. Questo preparato in modo specifico riferimento alla arteriola gracilis in un topo come microvasi di scelta, ma la preparazione di base può essere facilmente applicata alle navi isolati da quasi qualsiasi altro tessuto o organo tra le specie 9-13. Meccanica (cioè, dimensionale) cambiamenti nel isolato microvasi può essere facilmente valutatain risposta ad una vasta gamma di fisiologico (ad esempio, ipossia, pressione intravascolare, o taglio) o sfide farmacologici, e può fornire informazioni sul elementi meccanici comprendenti risposte integrati in uno intatto, sebbene ex vivo, tessuto. Il significato di questo metodo è che permette la manipolazione facile delle influenze sulla regolazione integrata del diametro microvasi, consentendo anche per il controllo di molti dei contributi provenienti da altre fonti, compresa la pressione intravascolare (miogenico), innervazione autonomica, emodinamica ( ad esempio, sforzo di taglio), stimoli endoteliali dipendenti o indipendenti, e le influenze ormonali, parenchimali, per fornire una lista parziale. Sotto opportune condizioni sperimentali e con obiettivi adeguati, questo può servire come un vantaggio rispetto in vivo o in situ di tessuti / organi preparati, che non consentono facilmente per il controllo di facile ampie variabili sistemiche.
La maJor limitazione di questa preparazione è essenzialmente la conseguenza delle sue forze. Per definizione, il comportamento di questi vasi è stata studiata in condizioni in cui molti dei contributi più significativi alla regolamentazione della resistenza vascolare sono state rimosse, compresa neurale, umorale, metabolica, ecc Come tale, l'investigatore è avvertiti di evitare un eccesso di interpretazione e estrapolazione dei dati raccolti utilizzando questa preparazione. L'altro significativo di preoccupazione per questa preparazione è che può essere molto facile danneggiare componenti cellulari come il rivestimento endoteliale o al muscolo liscio vascolare, tale fonte variabile di errore può essere introdotto. Si raccomanda vivamente che il singolo ricercatore utilizzare misure appropriate per garantire la qualità della preparazione, sia durante la fase iniziale dell'esperimento e periodicamente nel corso di un protocollo.
Protocol
Discussion
Il protocollo presentato descrive la cannulazione isolamento, rimozione e di un doppio microvasi muscolo scheletrico, sebbene questa tecnica generale può essere facilmente applicato alla maggior parte dei tessuti. Per il manoscritto attuale, il termine "arteriole" è stato utilizzato dagli autori per descrivere una nave resistenza compresa tra 70-120 micron di diametro a riposo sotto tono attivo, che è anche un importante contributo alla regolazione della resistenza perfusione ad un organo o tessuto.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (EIA 0740129N) e NIH T32 HL90610.
Materials
| Reagents and Equipment | Company | Comments/Catalogue # |
| Vessel Chamber | Custom | Dave Eick (MCW) |
| Heated Circulating Water Bath | PolyScience and Haake | Haake DC 10 |
| Pipets | Frederick Haer & Co. | Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1) |
| Pressure Monitor | World Precision Instruments | |
| Water Jacketed Reservoir | Custom | |
| External Light Source | World Precision Instruments | Novaflex |
| Pipet Puller | MicroData Instruments | PMP102 Micropipet Puller |
| Full complement of surgical tools | Fine Science Tools | Dumont |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | Inox #5 |
| Silk Suture Thread | Ethilon | #10-0 or 9-0 |
| Stereo Microscope | Olympus | Olympus SZ-11 |
| Analog Video Calipers | Boeckeler | Via Controller (Via-100) |
| High Resolution Analog Camera | Panasonic | GP-MF 602 |
| Oxygen Tank | Regional | 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen |
| Tubing | Tygon | |
| Drain Pump | Cole Parmer Instrument Co. | |
| Modified Rat PSS | See recipe below | |
| Van Breemen’s Relaxant PSS | See recipe below |
Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.
| Modified Rat PSS Recipe | To make two liters of PSS | 20X Salt Stock (2L) | 20X Buffer Stock (2L) |
| NaCl | 278.0 g | ||
| KCl | 14.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 11.5 g | ||
| CaCl2-H2O | 9.4 g | ||
| NaHCO3 | 80.8 g | ||
| EDTA | 0.4 g | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.
Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.
| Van Breemen’s Relaxant PSS | To make 2 liters of PSS | 20X Salt Stock (1L) | 20X Buffer Stock (1L) |
| NaCl | 107.4 g | ||
| KCl | 7.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 5.76 g | ||
| MgCl2-6H2O | 81.32 g | ||
| NaHCO3 | 40.4 g | ||
| EDTA | 0.2 g | ||
| EGTA | 15.22 | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.
Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.
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