לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם
Summary
<em> לשעבר vivo</emהכנה> מתואר על הבידוד של השרירים הגדולים gracilis arterioles ההתנגדות לחקירה של שני כלי דם התגובות לגירויים vasoactive והערכת תכונות מבניות בסיסיות באמצעות מכניקת קיר פסיביים.
Abstract
הכנה microvessel מבודד הוא הכנה vivo לשעבר המאפשר בחינה של תרומות שונות של גורמים בקוטר כלי שליטה, וכך, התנגדות זלוף 1-5. זהו תכשיר ניסיוני קלאסי זה היה, במידה רבה, תיאר בתחילה על ידי אושידה et al. 15 לפני כמה עשורים. זה תיאור ראשוני סיפק את הבסיס הטכניקות שונה בהרחבה משופרת, בעיקר במעבדה של ד"ר בריאן Duling באוניברסיטת וירג'יניה 6-8, ואנחנו מציגים גישה הנוכחי בעמודים הבאים. הכנה זו באופן ספציפי מתייחסים עורקיק gracilis בחולדה כמו microvessel של בחירה, אבל ההכנה הבסיסית יכול בקלות להיות מיושם על כלי מבודדים מרקמת כמעט כל איבר אחר או על פני מינים 9-13. מכני (כלומר, מימדי) שינויים microvessels בודד יכול בקלות לעבור הערכהבתגובה מגוון רחב של פיזיולוגיים (למשל, לחץ היפוקסיה, intravascular, או גזירה) או אתגרים תרופתי, והוא יכול לספק תובנות לגבי האלמנטים המרכיבים מכניסטית תגובות המשולבים ללא פגע, אם כי רקמת vivo לשעבר. המשמעות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת מניפולציה קליל של ההשפעות על תקנה משולבת של קוטר microvessel, תוך המאפשר שליטה של רבים תרומות ממקורות אחרים, כולל לחץ intravascular (myogenic), עצבוב האוטונומית, hemodynamic ( למשל, מאמץ גזירה), גירויים התלויים או עצמאית אנדותל, הורמונליים, והשפעות parenchymal, כדי לספק רשימה חלקית. תחת תנאי הניסוי מתאימים ועם המטרות המתאימות, זה יכול להוות יתרון על פני in vivo או ברקמות / איברים ההכנות באתרו, שאינם מאפשרים בקלות עבור קליל של משתנים מערכתיות רחבות יותר.
תואר שניהגבלה יור הכנה זו היא למעשה תולדה של נקודות החוזק שלה. על פי ההגדרה, את ההתנהגות של הכלים האלה הוא נחקר בתנאים בהם רבים התורמים המשמעותיים ביותר בוויסות של התנגדות כלי הדם הוסרו, כולל עצבית, הלחות, חילוף החומרים וכו 'על כן, החוקר הוא הזהיר, כדי למנוע יתר פרשנות אקסטרפולציה של הנתונים אשר נאספו תוך שימוש בתכשיר זה. אזור משמעותי אחר של דאגה לגבי הכנה זו היא כי זה יכול להיות קל מאוד לגרום נזק לרכיבים תאיים כמו רירית האנדותל או השריר החלק בכלי הדם, כגון מקור משתנה הטעות יכול להיות מוצג. מומלץ מאוד כי החוקר הפרט לנצל מדידות מתאימים כדי להבטיח את איכות של התכשיר, הן התחלת הניסוי ומדי פעם במהלך כל פרוטוקול.
Protocol
Discussion
פרוטוקול הציג מתאר cannulation, בידוד הסרת כפולה של microvessel שרירי השלד, אם כי טכניקה זו בכלל ניתן ליישם בקלות ברוב הרקמות. על כתב היד הנוכחי, המונח "עורקיק" נוצל בעבר על ידי החוקרים לתאר כלי התנגדות נע בין 70-120 מיקרומטר בקוטר תחת הטון פעיל מנוחה, שהיא גם תורמת רבות תקנה הה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני (EIA 0740129N) ו NIH T32 HL90610.
Materials
| Reagents and Equipment | Company | Comments/Catalogue # |
| Vessel Chamber | Custom | Dave Eick (MCW) |
| Heated Circulating Water Bath | PolyScience and Haake | Haake DC 10 |
| Pipets | Frederick Haer & Co. | Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1) |
| Pressure Monitor | World Precision Instruments | |
| Water Jacketed Reservoir | Custom | |
| External Light Source | World Precision Instruments | Novaflex |
| Pipet Puller | MicroData Instruments | PMP102 Micropipet Puller |
| Full complement of surgical tools | Fine Science Tools | Dumont |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | Inox #5 |
| Silk Suture Thread | Ethilon | #10-0 or 9-0 |
| Stereo Microscope | Olympus | Olympus SZ-11 |
| Analog Video Calipers | Boeckeler | Via Controller (Via-100) |
| High Resolution Analog Camera | Panasonic | GP-MF 602 |
| Oxygen Tank | Regional | 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen |
| Tubing | Tygon | |
| Drain Pump | Cole Parmer Instrument Co. | |
| Modified Rat PSS | See recipe below | |
| Van Breemen’s Relaxant PSS | See recipe below |
Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.
| Modified Rat PSS Recipe | To make two liters of PSS | 20X Salt Stock (2L) | 20X Buffer Stock (2L) |
| NaCl | 278.0 g | ||
| KCl | 14.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 11.5 g | ||
| CaCl2-H2O | 9.4 g | ||
| NaHCO3 | 80.8 g | ||
| EDTA | 0.4 g | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.
Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.
| Van Breemen’s Relaxant PSS | To make 2 liters of PSS | 20X Salt Stock (1L) | 20X Buffer Stock (1L) |
| NaCl | 107.4 g | ||
| KCl | 7.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 5.76 g | ||
| MgCl2-6H2O | 81.32 g | ||
| NaHCO3 | 40.4 g | ||
| EDTA | 0.2 g | ||
| EGTA | 15.22 | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.
Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.
References
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
- Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
- LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
- Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
- Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
- Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d’Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
- Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
- Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. s. o. l. a. t. e. d., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. 32, 435-456 (1995).
- Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).
