وصفها الأيضية من الحمض النووي الريبي كتب حديثا للدقة عالية التنميط التعبير الجيني من تخليق الحمض النووي الريبي، ومعالجة تسوس في خلية ثقافة
Summary
يوفر مجموع RNA الخلوية قالب الفقيرة لدراسة التغيرات قصيرة الأجل في تخليق الحمض النووي الريبي والاضمحلال وكذلك حركية معالجة RNA. هنا، نحن تصف وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouridine تليها biotinylation ثيول محددة وتنقية RNA المحولة حديثا السماح للتغلب على هذه القيود.
Abstract
تطوير ميكروأرس كامل Transcriptome على وتسلسل الجيل القادم قد أحدثت ثورة فهمنا من تعقيد الخلوية التعبير الجيني. جنبا إلى جنب مع فهم أفضل للآليات الجزيئية المسؤولة، أصبحت قياسات دقيقة لحركية الكامنة ذات أهمية متزايدة. هنا، تواجه هذه المنهجيات قوية قيود كبيرة بسبب الخصائص الذاتية من العينات قالب التي يدرسونها، أي الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية. في كثير من الحالات تغيرات في الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية تحدث إما ببطء شديد أو بسرعة كبيرة جدا لتمثيل الأحداث الجزيئية الكامنة وحركية مع القرار كافية. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم التمييز بينها بسهولة مساهمة تغييرات في تركيب الحمض النووي الريبي، وتجهيز، والاضمحلال.
وضعنا مؤخرا عالية الدقة الجينات التنميط التعبير للتغلب على هذه القيود. ويستند نهجنا على وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا مع 4 thiouriتناول الطعام (وبالتالي يشار إلى 4sU الجغرافية أيضا)، يليه تنقية صارمة من الحمض النووي الريبي كتب حديثا باستخدام biotinylation ثيول محددة والخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. وهو ينطبق على طائفة واسعة من الكائنات الحية بما فيها الحيوانات الفقارية، ذبابة الفاكهة، والخميرة. طبقنا بنجاح 4sU الجغرافية لدراسة حركية في الوقت الحقيقي من أنشطة عامل النسخ، وتوفير قياسات دقيقة من الحمض النووي الريبي نصف حياة، والحصول على رؤى جديدة في حركية معالجة RNA. وأخيرا، والنمذجة الحسابية يمكن استخدامها لتوليد تحليل متكامل وشامل من الآليات الجزيئية الكامنة.
Introduction
التنميط الجيني التعبير هي أداة رئيسية تستخدم لدراسة العمليات الخلوية وشبكة التفاعل المعقد المرتبطة بها. وكانت الدراسات على وفرة مرنا عادة الأسلوب المفضل للحصول على رؤى الأساسية في الآليات الجزيئية الكامنة. غذى تطوير ميكروأرس كامل Transcriptome على 1، وفي الآونة الأخيرة، تسلسل الجيل القادم من الحمض النووي الريبي (RNA وما يليها) 2-4 هذا النهج. في حين أن هذه التقنيات قد أحدثت ثورة فهمنا من تعقيد الخلوية التعبير الجيني، فإنهم يواجهون قيودا كبيرة بسبب الخصائص الذاتية من عينة قالب بهم، أي مجموع الخلوية الحمض النووي الريبي. التغييرات الأولى، على المدى القصير في مجموع مستويات الحمض النووي الريبي لا تتطابق التغيرات في أسعار النسخ، ولكنها تعتمد بطبيعتها على الحمض النووي الريبي نصف العمر من النصوص منها. في حين أن الاستقراء خمسة أضعاف من لم يدم طويلا نص، على سبيل المثال ترميز لعامل النسخ، وسوف يكون كشفها بسهولة في الحمض النووي الريبي مجموعفي غضون ساعة، نفس تحريض على الأجل الطويل نص، على سبيل المثال الترميز لانزيم الأيضية، وسوف تظل غير مرئية تقريبا. وبالإضافة إلى ذلك، حتى استكمال اغلاق القناة (> 1،000 أضعاف أسفل تنظيم) في معدل النسخ من الجين بمتوسط مع نصف عمر خمس ساعات RNA سوف ببساطة تأخذ خمس ساعات لمجموع مستويات الحمض النووي الريبي لينخفض بنسبة شقين فقط . ولذلك، فإن تحليل الحمض النووي الريبي مجموع تفضل الكشف عن ما يصل التنظيم من النصوص لم يدم طويلا، وكثير منها ترميز لعوامل النسخ والجينات مع المهام التنظيمية 5. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حجب تتالي الحركية الحقيقية للتنظيم، ولا يمكن أن تكون متباينة الأحداث يشير الأساسي من الثانوي. كلا، بدوره، قد يؤدي إلى تحيز كبير في التحليلات المعلوماتية الحيوية المصب. ثانيا، لا يمكن أن تعزى التغيرات في إجمالي مستويات الحمض النووي الريبي للتغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي أو تسوس. قياسات لهذه الأخيرة تتطلب نهجا الغازية الخلية، على سبيل المثال حظر transcriptiحول استخدام أكتينوميسين D 6، ورصد طويلة من الاضمحلال RNA الجارية مع مرور الوقت. بمتوسط مرنا نصف العمر في خلايا الثدييات من 5-10 ساعة 5،7، لن يؤدي إلا إلى فقد انخفضت مستويات مرنا من معظم الجينات بنسبة أقل من شقين بعد عدة ساعات من اعتقال النسخي. هذه الاختلافات الصغيرة بدلا يؤدي إلى قياسات غير دقيقة بشكل فاضح من مرنا نصف العمر بالنسبة لغالبية الجينات الخلوية نظرا لطبيعة الأسي من المعادلات الرياضية الكامنة. وأخيرا، بينما RNA وما يليها من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية كشفت أن ما يقرب من نصف جيناتنا تخضع لأحداث بديلة الربط 8، حركية الكامنة فضلا عن آليات ديناميكية توجيه الأنسجة ومحددة السياق تنظيم معالجة الحمض النووي الريبي لا تزال غير مفهومة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مساهمة RNA تجهيز لتباين التعبير الجيني، ولا سيما بالنسبة للالرناوات غير الترميز، لا يزال يتعين تحديدها. وإجمالا، هذه القيود تمثل العقبات الرئيسية للالنمذجة المعلوماتية الحيوية الحركية من الآليات الجزيئية الكامنة.
وضعنا مؤخرا نهجا، ووصف الجينات وارتفاع القرار التنميط التعبير، للتغلب على هذه المشاكل 5،7،9. لأنه يقوم على وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا باستخدام 4-thiouridine (4sU الجغرافية)، وهو مشتق يوريدين التي تحدث بشكل طبيعي، ويوفر الوصول المباشر إلى النصوص المحولة حديثا مع الحد الأدنى من التدخل في نمو الخلايا والتعبير الجيني (انظر الشكل 1) 5، 10-12. التعرض للخلايا حقيقية النواة إلى نتائج 4sU في امتصاص على وجه السرعة، الفسفرة إلى 4sU-ثلاثي الفوسفات، وإدماجها في الحمض النووي الريبي المحولة حديثا. بعد عزل الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية، الكسر RNA 4sU المسمى هو البيروكسيديز ثيول على وجه التحديد توليد السندات ثاني كبريتيد بين البيوتين وRNA المحولة حديثا. 'مجموع RNA الخلوية' ثم يمكن فصل كميا في المسمى ('المحولة حديثا') وتوضيحها ("ما قبل existinز ') RNA مع نقاء عالية باستخدام الخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. وأخيرا، يتم استرداد المسمى الحمض النووي الريبي من الخرز ببساطة عن طريق إضافة عامل مختزل (على سبيل المثال dithiothreitol) الشق السندات ثاني كبريتيد والافراج عن RNA المحولة حديثا من الخرز.
كتب حديثا RNA يصور النشاط النسخي من كل جين خلال الإطار الزمني للتعرض 4sU. 4sU الجغرافية في مقياس الوقت من دقيقة وبالتالي يقدم صورة لقطة من حقيقية النواة التعبير الجيني وقالب مثالي لأسفل مجرى التحليلات المعلوماتية الحيوية (مثل تحليل المروج). في الحالات التي يمكن افتراض ظروف الحالة المستقرة، نسب المحولة حديثا / المجموع، كتب حديثا / الخالي من الملصقات وغير المسماة / الحمض النووي الريبي مجموع توفير وصول غير الغازية لRNA دقيق نصف حياة 7،13. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن الحمض النووي الريبي المحولة حديثا تنقيته بعد اقل من 5 دقائق من 4sU الجغرافية (5 دقائق 4sU-RNA) هو أصغر من 15 و 60 دقيقة 4sU-RNA.عند تنفيذ كلا فائقة القصيرة والطويلة تدريجيا 4sU الجغرافية في إعداد تجريبية واحدة جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي وما يليها، وكشف حركية معالجة الحمض النووي الريبي في قرار النوكليوتيدات 9. وأخيرا، تحليلات الوقت طبعا من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا ومجموع جنبا إلى جنب مع النمذجة الحاسوبية تسمح لتحليل تكاملية تخليق الحمض النووي الريبي والاضمحلال 14.
وفي الختام، فإن هذا النهج يسمح للتحليل المباشر لديناميات توليف الحمض النووي الريبي، وتجهيز، وتدهور في الخلايا حقيقية النواة. هذا ينطبق في جميع الكائنات الحية بما فيها الثدييات نموذج رئيسي والحشرات (ذبابة الفاكهة)، البرمائيات (الضفدع)، والخميرة 5،15،16. وهو متوافق مباشرة مع تحليل ميكروأري 5،17، RNA-يليها 9،13،14، وينطبق في الجسم الحي 12،15. هنا، ونحن بالتفصيل منهجية لتسمية وعزل، وتنقية RNA المحولة حديثا في خلايا الثدييات مثقف. وبالإضافة إلى ذلك، potentiوتناقش المشاكل القاعدة والمزالق.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي المحولة حديثا يعزز بشكل كبير من قوة تكنولوجيات عالية الإنتاجية مثل ميكروأرس وRNA وما يليها من خلال توفير قوالب أكثر ملاءمة لمعالجة هذه المسألة البيولوجية من الفائدة. خضع هذا البروتوكول الأمثل واسعة النطاق. لأنها تتيح تخصيب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر إيمي ريغان لقراءة متأنية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل NGFN زائد منحة # 01GS0801، MRC زمالة منحة G1002523 وNHSBT منحة WP11-05 إلى LD وDFG منحة FR2938/1-1 إلى CCF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
References
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
- Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
- Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
- Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
- Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
- Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
- Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
- Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
- Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
- Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
- Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
- Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
- Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
- Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).
