Метаболический маркировки Недавно Transcribed РНК за большой размер профилирования экспрессии генов синтеза РНК, производство и разложение в культуре клеток
Summary
Всего клеточной РНК обеспечивает плохое шаблон для изучения краткосрочных изменений в синтез РНК и распада, а также кинетики процессинга РНК. Здесь мы описываем метаболический маркировки вновь транскрипции РНК с 4-тиоуридина последующим тиол-специфический биотинилирования и очистки вновь транскрипции РНК позволяющих преодолеть эти недостатки.
Abstract
Развитие целого транскриптома микрочипы и следующего поколения секвенирования революцию в нашем понимании сложности клеточной экспрессии гена. Наряду с лучшего понимания молекулярных механизмов, вовлеченных, точные измерения основных кинетики становятся все более важными. Здесь эти мощные методологии сталкиваются с серьезными ограничениями в силу внутренних свойств шаблона образцы, которые они изучают, т.е. общей клеточной РНК. Во многих случаях изменения общей клеточной РНК происходить либо слишком медленно или слишком быстро, чтобы представлять основные молекулярные события и их кинетики с достаточным разрешением. Кроме того, вклад в изменение синтеза РНК, обработки и распада не легко дифференцированы.
Мы недавно разработали высокого разрешения профилирования экспрессии генов для преодоления этих ограничений. Наш подход основан на метаболические маркировки вновь транскрипции РНК с 4-thiouriеды (так называемый также 4SU-тегов), а затем строгий очистки вновь транскрипции РНК с использованием тиол-специфический биотинилирования и покрытые стрептавидином магнитные гранулы. Он применим к широкому кругу организмов, включая позвоночных, дрозофилы и дрожжей. Мы успешно применяется 4SU-тегов для изучения реального времени кинетики активности транскрипционных факторов, обеспечивают точные измерения РНК период полураспада, и получить новые понимания кинетики процессинга РНК. Наконец, компьютерное моделирование может быть использовано для создания комплексного, всестороннего анализа основных молекулярных механизмов.
Introduction
Профилирования экспрессии генов является ключевым инструментом, используемым для изучения клеточных процессов и связанных с ними сложная сеть взаимодействий. Исследования по мРНК изобилие как правило, были методом выбора для получения основной проницательности в основные молекулярные механизмы. Развитие целого транскриптома микрочипов 1 и, совсем недавно, следующего поколения секвенирования РНК (РНК-SEQ) 2-4 подпитывается этот подход. Однако эти технологии пока революцию в нашем понимании сложности клеточной экспрессии гена, они сталкиваются с серьезными ограничениями в силу внутренних свойств их шаблон образца, т.е. общей клеточной РНК. Во-первых, краткосрочные изменения общего уровня РНК не соответствуют изменениям в транскрипции ставки, но по своей природе в зависимости от РНК полураспада соответствующих транскриптов. В то время как пятикратный индукции недолгим стенограммы, например, кодирование для фактора транскрипции, будет легко обнаружить в общей РНКв течение часа, то же индукция долгоживущих стенограммы, например, кодирование для метаболических ферментов, останется практически невидимым. Кроме того, даже полное отключение (> 1000 раз понижающая регуляция) в транскрипции скорость средний ген РНК полураспада пяти часов будут просто принимать пять часов для общего уровня РНК уменьшить лишь два раза . Таким образом, анализ общей РНК способствует обнаружению повышающей регуляции недолго транскриптов, многие из которых кодируют факторы транскрипции и гены регулирующие функции 5. Кроме того, истинная кинетическая каскад регулирования затемняется и первичных сигнальных событий не может быть дифференцирована от вторичной. И, в свою очередь, может привести к существенной смещение в последующих анализов биоинформатики. Во-вторых, изменения в общих уровней РНК не могут быть отнесены к изменениям в синтез РНК или распада. Измерения последние требуют инвазивных подходов клетки, например, блокирование transcriptiпо использованию актиномицином D 6 и расширенный мониторинг текущих распада РНК с течением времени. При средней мРНК период полураспада в клетках млекопитающих, 5 – 10 ч 5,7, уровни мРНК большинство генов только уменьшились на менее чем в два раза после нескольких часов транскрипционный сердца. Эти довольно небольшие различия привести грубую и неточную мРНК измерений периода полураспада для большинства клеточных генов в связи с экспоненциальным характером основного математических уравнений. Наконец, в то время как РНК-сл полной клеточной РНК показал, что приблизительно половина наших генов могут быть альтернативные сплайсинга 8, лежащие в основе кинетики, так и динамических механизмов направляющий ткани и зависит от конкретных условий регулирования процессинга РНК еще мало изучены. Кроме того, вклад процессинг РНК к дифференциальной экспрессии генов, в частности для некодирующих РНК, еще предстоит определить. В целом, эти ограничения представляют собой серьезные препятствия длябиоинформационных кинетических моделей основных молекулярных механизмов.
Недавно мы разработали подход, названный высоким разрешением профилирования экспрессии генов, чтобы преодолеть эти проблемы 5,7,9. Он основан на метаболические маркировки вновь транскрипции РНК с использованием 4-тиоуридина (4SU-тегов), встречающегося в природе уридином производной, и обеспечивает прямой доступ к новой транскрипции стенограммы с минимальным вмешательством в рост клеток и экспрессии генов (см. Рисунок 1) 5, 10-12. Воздействие эукариотической клетки 4SU приводит к ее быстрому поглощению, фосфорилирования 4SU-трифосфат, и включения в новый транскрипции РНК. После выделения общей клеточной РНК, 4SU-меченой РНК фракции тиол-конкретно биотинилированный генерации дисульфидную связь между биотин и вновь транскрипции РНК. "Общую клеточную РНК 'может быть количественно разделить на помечены (' вновь транскрипции ') и немеченого (' предварительно existinг ') РНК с высокой чистотой использованием покрытых стрептавидином магнитных шариков. Наконец, меченой РНК выделяют из шариков путем простого добавления восстанавливающего агента (например дитиотреитола) расщепление дисульфидных связей и выпуск новой транскрипции РНК из шариков.
Недавно транскрипции РНК изображает транскрипционной активности каждого гена в течение срока от 4SU экспозиции. 4SU-тегов в сроки минут таким образом, обеспечивает картинку эукариотической экспрессии генов и идеальный шаблон для вниз по течению биоинформатики анализов (например, промоутер анализ). В случаях, когда стационарных условиях можно предположить, отношения вновь транскрипции / общий, недавно транскрибируется / немеченными и немеченым / общей РНК обеспечивает неинвазивный доступ к точной РНК полураспада 7,13. Кроме того, важно отметить, что недавно транскрипции РНК очищенный после всего лишь 5 мин 4SU-тегов (5 мин 4SU-РНК) моложе 15 и 60 мин 4SU-РНК.При выполнении как ультра-короткие и прогрессивно больше 4SU-тегов в одну экспериментальную установку в сочетании с РНК-SEQ, кинетика процессинг РНК выявлены у нуклеотидных резолюции 9. Наконец, время курса анализы вновь Записал и общей РНК в сочетании с компьютерного моделирования позволяют интегративный анализ синтез РНК и распада 14.
В заключение, этот подход позволяет для прямого анализа динамики синтеза РНК, обработки и деградации в эукариотических клетках. Она применима во всех основных модельных организмов, включая млекопитающих, насекомых (Drosophila), земноводные (Xenopus) и дрожжи 5,15,16. Это непосредственно совместимы с анализ микрочипов 5,17 РНК-далее 9,13,14 и применимо в естественных условиях 12,15. Здесь мы подробно описываем методику на этикетке, изолировать и очистить вновь транскрипции РНК в культивируемых клетках млекопитающих. Кроме того, потенциометрдр. проблем и подводных камней, обсуждаются.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метаболический маркировки вновь транскрипции РНК существенно повышает мощность высокопроизводительных технологий, как микрочипы и РНК-SEQ, предоставляя более подходящие шаблоны для решения биологических вопросов, представляющих интерес. Настоящий Протокол проводился капитальный о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Amie Риган за внимательное чтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом NGFN Plus # 01GS0801, MRC G1002523 стипендии, гранты и NHSBT WP11-05 LD и гранта DFG FR2938/1-1 к CCF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
References
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
- Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
- Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
- Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
- Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
- Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
- Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
- Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
- Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
- Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
- Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
- Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
- Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
- Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).
