Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme
Summary
Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.
Abstract
Tam transcriptome mikroarrayler ve yeni nesil sıralama gelişimi hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim yarattı. Tutulan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile birlikte, altta yatan kinetik hassas ölçümler giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bu güçlü yöntemler şablon örnekleri de çalışma, yani toplam hücresel RNA içsel özellikleri nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. Birçok durumda toplam hücresel RNA değişiklikler yeterli çözünürlüğe sahip temel moleküler olayları ve kinetik temsil etmek için ya çok yavaş ya da çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Buna ek olarak, RNA sentezi, işlenmesi ve çürüme değişiklikler katkısı kolayca ayırt edilmez.
Biz son zamanlarda bu sınırlamaları aşmak için yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili geliştirdi. Yaklaşımımız 4-thiouri ile yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayanmaktadıryemek (böylece de 4SU-etiketleme olarak anılacaktır) tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yeni kopyalanan RNA arasında sıkı bir arıtma takip eder. Bu, omurgalılarda, Drosophila ve maya da dahil olmak üzere bir organizma geniş için de geçerlidir. Biz başarılı, transkripsiyon faktörü faaliyetlerinin gerçek zamanlı kinetik çalışma RNA yarı hayatımızın hassas ölçümler sağlamak ve RNA işleme kinetik yeni bakış açıları elde etmek için 4SU-etiketleme uygulanır. Son olarak, sayısal modelleme altta yatan moleküler mekanizmaları entegre, kapsamlı bir analiz oluşturmak için kullanılabilir.
Introduction
Gen ekspresyon profili hücresel süreçleri ve ilgili karmaşık bir etkileşim ağı incelemek için kullanılan önemli bir araçtır. MRNA bolluk ile ilgili çalışmalar genellikle altta yatan moleküler mekanizmaları, temel anlayışlar elde etmek için tercih edilen yöntem olmuştur. Tam transcriptome mikroarrayler 1 ve RNA (RNA-seq) 2-4 daha yakın, yeni nesil sıralama gelişimi bu yaklaşım hızlandırdı. Bu teknolojilerin hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim olsa da, onların şablon örnek doğal özelliklerine, yani toplam hücresel RNA nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. RNA düzeylerinde İlk olarak, kısa vadeli değişiklikler transkripsiyon oranlarındaki değişimler maç, ancak RNA ilgili transkript yarı ömrü üzerinde doğal olarak bağımlı değildir. Bir transkripsiyon faktörü için kısa süreli bir transkript, örneğin kodlama beş kat indüksiyon, toplam RNA kolayca tespit olacak isebir saat içinde, bir metabolik enzim için uzun ömürlü transkript, örneğin kodlama aynı indüksiyon, neredeyse görünmez kalacaktır. Buna ek olarak, hatta bir kapatma (> 1.000 kat yük atma) bir RNA beş saatlik yarılanma ömrü ile ortalama bir genin transkripsiyon oranı tam sadece sadece iki yönlü tarafından azaltmak için, toplam RNA düzeyleri için beş saat sürer . Bu nedenle, toplam RNA analizi düzenleme fonksiyonları 5 ile transkripsiyon faktörleri ve genler için kodlamak birçoğu kısa ömürlü transkript kadar düzenleme tespiti, yanadır. Ayrıca, düzenlemenin gerçek kinetik kaskad gizlenmiş ve birincil sinyal olaylar ikincil ayırt edilemez. Her ikisi de, sırayla, alt biyoinformatik analizler önemli sapmayla neden olabilir. İkinci olarak, toplam RNA düzeylerinde değişiklikler RNA sentezi ya da çürüme değişikliklere mal edilemez. Ikinci ölçümleri transcripti engelleme hücre invaziv yaklaşımlar, örneğin gerektiriraktinomisin D 6, ve zaman içinde devam eden RNA çürüme genişletilmiş izleme kullanarak. 5 memeli hücrelerinde ortalama mRNA yarı ömrü ile – 10 saat 5,7, en genlerin mRNA düzeyleri sadece iki kat transkripsiyonel tutuklama birkaç saat sonra daha az azalmıştır olacaktır. Bunlar, çok küçük farklar temel matematiksel denklem üslü doğası nedeniyle hücresel genlerin çoğu için mRNA'nın yarı ömür kabaca kesin ölçümler ile sonuçlanabilir. Son olarak, süre toplam hücresel RNA RNA-seq genlerimizin yarısını yaklaşık alternatif yapıştırma olayları 8, temel kinetik hem de tam olarak anlaşılamamıştır kalır RNA işleme doku ve bağlama özgü düzenleme rehberlik dinamik mekanizmaları tabi olduğunu ortaya koydu. Buna ek olarak, RNA, özellikle katkı kodlayıcı olmayan RNA'lar için, belirlenecek kalır, diferansiyel gen ekspresyonu için işlem. Toplamda, bu sınırlamalar için önemli engeller temsilaltta yatan moleküler mekanizmaların biyoinformatik kinetik modelleme.
Yakın zamanda bu sorunların 5,7,9 üstesinden gelmek için, olarak adlandırılan yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili, bir yaklaşım geliştirdi. Bu, 4-thiouridine (4SU-etiketleme), doğal olarak oluşan üridin türev kullanarak yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayalı ve hücre büyümesi ve gen ekspresyon minimal girişim (bkz. Şekil 1) 5 ile yeni transkripsiyonu transkript doğrudan erişim sağlar 10-12. Hızla alımı, 4SU-trifosfat için fosforilasyon, ve yeni transkripsiyonu RNA içine dahil edilmesi 4SU sonuçlarına ökaryot hücrelerin maruz kalma. Toplam hücresel RNA izole edildikten sonra, 4SU-işaretli RNA fraksiyonu tiol-biotin ve özellikle yeni kopyalanan RNA arasında bir disülfid bağı oluşturma biyotinile olup. 'Toplam hücresel RNA' ardından nicel ('yeni transkripsiyonu') ve etiketsiz ('öncesi existin etiketli ayrılabilirStreptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yüksek saflıkta G ') RNA dır. Son olarak, etiketli RNA sadece disülfid bağ yarma bir indirgeyici madde (örneğin, ditiyotreitol) eklenmesi ve Tanelerden yeni kopyalanan RNA bırakarak Tanelerden geri kazanılır.
Yeni transkripsiyonu RNA 4SU maruz kalma süre boyunca her genin transkripsiyonel aktivitesini gösteriyor. Dakika ölçeğinde 4SU-etiketleme böylece ökaryotik gen ifadesinin bir anlık görüntü ve aşağı akım biyoinformatik analizleri (promotor analizi) için ideal bir şablon sağlar. Kararlı durum koşulları kabul edilebilir durumda, oranları yeni transkripsiyonu / toplam, yeni transkripsiyonu / etiketsiz ve etiketsiz / RNA hassas RNA yarı ömrü 7,13 için non-invaziv erişim sağlar. Buna ek olarak, 4SU-etiketleme az 5 dakika (5 dakika 4SU-RNA) sonra arıtılmış bu yeni transkripsiyonu RNA dikkat etmek önemlidir 15 ve 60 dakika 4SU-RNA daha gençtir.RNA-seq ile birlikte tek bir deneysel ortamda 4SU-etiketleme ultra-kısa ve giderek daha uzun hem yaparken, RNA işleme kinetik nükleotid çözünürlükte 9 ortaya çıkar. Son olarak, sayısal modelleme ile birlikte yeni transkripsiyonu ve toplam RNA zaman tabii ki analiz RNA sentezi ve çürüme 14 entegre bir analiz sağlar.
Sonuç olarak, bu yaklaşım, ökaryotik hücrelerde RNA sentezi, işleme ve bozulmanın dinamiklerinin doğrudan analizi sağlar. Bu memeliler, böcekler (Drosophila), amfibi (Xenopus), ve maya 5,15,16 dahil olmak üzere tüm büyük model organizmalarda geçerlidir. Bu mikroarray analizi 5,17, RNA-seq 9,13,14 ile doğrudan uyumludur, ve in vivo 12,15 uygulanabilir. Burada, detaylı metodoloji, etiket izole ve kültürlü memeli hücrelerinde yeni transkripsiyonu RNA arındırmak için. Ayrıca, potansiyometre olarakal sorunlar ve tuzaklar tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yeni transkripsiyonu RNA Metabolik etiketleme ölçüde ilgi biyolojik soruya cevap daha uygun şablonlar sunarak mikroarrayler ve RNA-seq gibi yüksek verimli teknolojilerin gücünü artırır. İşbu Protokol kapsamlı optimizasyon yapıldı. Bu yeni transkripsiyonu RNA> 1000 kat zenginleştirme sağlar ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.
Yeni transkripsiyonu RNA sadece 4SU hücrelerin maruz kalma döneminde gerçek zamanlı transkripsiyonel aktivitesini tasvir gibi bir 4SU-e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının dikkatli bir okuma için Amie Regan teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma LD ve CCF için DFG hibe FR2938/1-1 için NGFN Artı hibe # 01GS0801, MRC dostluk hibe G1002523 ve NHSBT hibe WP11-05 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
References
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
- Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
- Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
- Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
- Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
- Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
- Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
- Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
- Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
- Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
- Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
- Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
- Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
- Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).
