Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture
Summary
Totaal cellulair RNA verschaft een slechte template voor het bestuderen korte termijn veranderingen in RNA synthese en verval en de kinetiek van RNA processing. We beschrijven hier metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine gevolgd door thiol-specifieke biotinylering en zuivering van nieuw getranscribeerde RNA waardoor deze beperkingen te overwinnen.
Abstract
De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays en next-generation sequencing heeft een revolutie ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie. Naast een beter begrip van de moleculaire mechanismen betrokken zijn nauwkeurige metingen van de onderliggende kinetiek steeds belangrijker geworden. Hier, deze krachtige methodieken staan voor grote beperkingen als gevolg van intrinsieke eigenschappen van de sjabloon monsters ze studeren, dwz totaal cellulair RNA. In veel gevallen optreden veranderingen in totaal cellulair RNA ofwel te langzaam of te snel om de onderliggende moleculaire gebeurtenissen en hun kinetiek vertegenwoordigen voldoende resolutie. Daarnaast wordt de bijdrage van veranderingen in RNA synthese, verwerking en verval niet gemakkelijk onderscheiden.
We hebben onlangs ontwikkelde hoge-resolutie genexpressieprofilering om deze beperkingen te overwinnen. Er wordt gebruik gemaakt van metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine (dus ook wel 4SU-tagging) gevolgd door strenge zuivering van nieuw RNA getranscribeerd met thiol-specifieke biotinylering en streptavidine beklede magnetische korrels. Het is toepasbaar op een breed scala aan organismen, waaronder gewervelden, Drosophila en gist. Wij hebben met succes 4SU-tagging toegepast om te studeren real-time kinetiek van transcriptiefactor activiteiten, nauwkeurige metingen van RNA halfwaardetijden, en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de kinetiek van RNA processing. Tenslotte kunnen computermodellen worden gebruikt om een geïntegreerde, alomvattende analyse van de onderliggende moleculaire mechanismen te genereren.
Introduction
Genexpressie is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt om cellulaire processen en de bijbehorende complexe interactie netwerk bestuderen. Studies over mRNA overvloed hebben meestal al de methode van keuze voor fundamentele inzichten te krijgen in de onderliggende moleculaire mechanismen. De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays 1 en, meer recentelijk, next-generation sequencing van RNA (RNA-seq) 2-4 aangewakkerd deze aanpak. Hoewel deze technologieën ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie hebben een revolutie, waarmee zij worden geconfronteerd grote beperkingen als gevolg van de intrinsieke eigenschappen van hun template monster, dwz totaal cellulair RNA. Eerste, korte-termijn veranderingen in totaal RNA niet overeenkomen veranderingen in transcriptiesnelheden, maar inherent afhankelijk RNA halfwaardetijd van de respectievelijke transcripten. Terwijl een vijfvoudige inductie van een kortstondige transcript, bijv. coderend voor een transcriptiefactor, zal gemakkelijk detecteerbaar in totaal RNAbinnen een uur, dezelfde inductie van een langlevende transcript, bijv. codeert voor een metabolisch enzym, zal vrijwel onzichtbaar blijven. Bovendien, zelfs een complete shut-down (> 1.000-voudig down-regulatie) in de transcriptie snelheid van een gemiddelde gen met een RNA halfwaardetijd van vijf uur zal nemen gewoon vijf uur om zijn totaal RNA niveaus dalen met slechts tweeledig . Daarom analyse van totaal RNA bevordert de detectie van opwaartse regulatie van kortlevende transcripten, waarvan vele coderen voor transcriptiefactoren en genen met regulerende functie 5. Daarnaast wordt de ware kinetische cascade van regulering verduisterd en primaire signalering evenementen kunnen niet worden onderscheiden van de secundaire. Beide zijn beurt kan leiden tot aanzienlijke vertekening in daaropvolgende bioinformatica analyses. Ten tweede, kunnen veranderingen in totaal RNA niveaus niet worden toegeschreven aan veranderingen in RNA synthese of verval. Metingen van de laatste eisen cel invasieve benaderingen, zoals het blokkeren van Transcriptiover het gebruik van actinomycine D 6, en uitgebreide monitoring van lopende RNA verval in de tijd. Met een gemiddelde mRNA halfwaardetijd in zoogdiercellen van 5-10 uur 5,7, wordt mRNA van de meeste genen slechts gedaald met minder dan twee keer na verscheidene uren van transcriptionele arrest. Deze vrij kleine verschillen leiden tot grove onnauwkeurige metingen van mRNA halfwaardetijden van de meeste cellulaire genen als gevolg van de exponentiële aard van de onderliggende wiskundige vergelijkingen. Tenslotte, terwijl de RNA-seq van totaal cellulair RNA bleek dat ongeveer de helft van onze genen kunnen alternatieve splicing gebeurtenissen 8, de onderliggende kinetiek en de dynamische mechanismen leidende weefsel-en context-specifieke regulatie van RNA processing blijven slecht begrepen. Bovendien is de bijdrage van RNA verwerking differentiële genexpressie, in het bijzonder voor niet-coderende RNA's, nog worden vastgesteld. Al met al, deze beperkingen vormen de belangrijkste obstakels voorbioinformatic kinetische modellering van de onderliggende moleculaire mechanismen.
Onlangs hebben we een aanpak ontwikkeld, genaamd hoge resolutie genexpressieprofilering, om deze problemen te overwinnen 5,7,9. Het is gebaseerd op metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA onder toepassing van 4-thiouridine (4SU-tagging), een natuurlijk voorkomende derivaat uridine en geeft direct toegang tot nieuw getranscribeerde transcripten met minimale tussenkomst in celgroei en genexpressie (zie figuur 1) 5, 10-12. Blootstelling van eukaryote cellen om 4SU resultaten in zijn snelle opname, fosforylering aan 4SU-trifosfaat, en incorporatie in nieuw getranscribeerde RNA. Na isolatie van totaal cellulair RNA, de 4SU-gelabelde RNA fractie thiol-specifiek gebiotinyleerd genereren van een disulfidebinding tussen de biotine en nieuw getranscribeerde RNA. 'Totaal cellulair RNA' kan dan kwantitatief worden gescheiden in het label ('nieuw getranscribeerd') en niet-gemerkte ('pre-existing ') RNA met hoge zuiverheid met streptavidine beklede magnetische korrels. Tenslotte wordt gelabeld RNA gewonnen uit de parels door het toevoegen van een reductiemiddel (bijvoorbeeld dithiothreitol) splitsen van het disulfide binding en het vrijgeven van de nieuw getranscribeerde RNA van de bolletjes.
Nieuw getranscribeerd RNA toont de transcriptionele activiteit van elk gen in het tijdsbestek van 4SU blootstelling. 4SU-tagging in de tijdschaal van minuten verschaft dus een momentopname van eukaryote genexpressie en een ideale sjabloon voor downstream-bioinformatica analyses (bv promotor analyse). In gevallen waarin steady-state omstandigheden kan worden aangenomen, de verhoudingen van nieuw getranscribeerd / totaal, opnieuw opgeschreven / ongelabelde en ongelabelde / totaal RNA bieden niet-invasieve en toegang tot nauwkeurige RNA halfwaardetijden 7,13. Bovendien is het belangrijk op te merken dat nieuw getranscribeerde RNA gezuiverd na slechts 5 min 4SU-tagging (5 min 4SU-RNA) jonger dan 15 en 60 min 4SU-RNA.Bij het uitvoeren van zowel de ultra-korte en progressief langere 4SU-tagging in een experimentele setting gecombineerd met RNA-seq, zijn de kinetiek van RNA processing onthuld op nucleotide resolutie 9. Tenslotte tijdsverloop analyses van nieuw getranscribeerd en totaal RNA gecombineerd met computermodellen laten een geïntegreerde analyse van RNA synthese en verval 14.
Kortom, deze benadering maakt de directe analyse van de dynamica van RNA-synthese, verwerking en afbraak in eukaryote cellen. Het is in alle belangrijke modelorganismen zoals zoogdieren, insecten (Drosophila), amfibieën (Xenopus), en gist 5,15,16 toepassing. Het is direct compatibel met microarray analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, en is in vivo 12,15 toepassing. Hier hebben we detail de methodologie te labelen, te isoleren en te zuiveren nieuw getranscribeerd RNA in gekweekte zoogdiercellen. Bovendien, potentiometeral problemen en valkuilen worden besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metabole etikettering van nieuw getranscribeerde RNA aanzienlijk versterkt de kracht van high-throughput technologieën zoals microarrays en RNA-seq door meer geschikte templates om de biologische vraag van belang aan te pakken. Het huidige protocol werd na optimalisatie. Het maakt> 1000-voudige verrijking van nieuw getranscribeerde RNA en biedt zeer reproduceerbare resultaten.
Het experimentele ontwerp van een 4SU-tagging experiment is van cruciaal belang als nieuw getranscribeerde RNA z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Amie Regan bedanken voor zorgvuldige lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NGFN Plus subsidie # 01GS0801, MRC fellowship subsidie G1002523 en NHSBT subsidie WP11-05 op LD en DFG subsidie FR2938/1-1 naar CCF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
References
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
- Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
- Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
- Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
- Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
- Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
- Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
- Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
- Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
- Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
- Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
- Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
- Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
- Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).
