Marquage métabolique de l'ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d'expression génique de l'ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire
Summary
L'ARN cellulaire total donne un mauvais modèle pour l'étude des changements à court terme dans la synthèse d'ARN et de la décomposition ainsi que les cinétiques de maturation de l'ARN. Ici, nous décrivons marquage métabolique des ARN transcrits récemment avec 4 thiouridine suivie par biotinylation et purification thiol-spécifique des ARN transcrits nouvellement permettant de surmonter ces limitations.
Abstract
Le développement de puces tout-transcriptome et le séquençage de prochaine génération a révolutionné notre compréhension de la complexité de l'expression des gènes cellulaires. Avec une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués, des mesures précises de la cinétique sous-jacents sont devenus de plus en plus importante. Ici, ces méthodes puissantes font face à des limitations dues aux propriétés intrinsèques des échantillons de modèle à savoir l'étude des ARN cellulaires, ils totales. Dans de nombreux cas, des changements dans l'ARN cellulaire total surviennent trop lentement ou trop rapidement pour représenter les événements moléculaires sous-jacents et leur cinétique avec une résolution suffisante. En outre, la contribution des altérations de la synthèse de l'ARN, le traitement et la décadence sont pas facilement différencié.
Nous avons récemment développé à haute résolution de l'expression génique pour surmonter ces limitations. Notre approche est basée sur le marquage métabolique de l'ARN nouvellement transcrit avec 4 thiouridine (donc également dénommé 4SU-marquage) suivie d'une purification rigoureuse de l'ARN transcrit à l'aide de nouveaux biotinylation thiol-spécifique et des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Il est applicable à un large éventail d'organismes, y compris les vertébrés, chez la drosophile et la levure. Nous avons appliqué avec succès 4SU-tagging pour étudier la cinétique en temps réel des activités de facteurs de transcription, fournir des mesures précises de l'ARN demi-vie, et obtenir de nouveaux aperçus sur les cinétiques de maturation de l'ARN. Enfin, la modélisation computationnelle peut être utilisée pour générer une analyse globale et intégrée des mécanismes moléculaires sous-jacents.
Introduction
Profil d'expression génique est un outil clé utilisé pour étudier les processus cellulaires et le réseau d'interaction complexe associé. Des études sur l'abondance de l'ARNm ont généralement été la méthode de choix pour obtenir un aperçu de base sur les mécanismes moléculaires sous-jacents. Le développement de puces tout-transcriptome 1 et, plus récemment, le séquençage de prochaine génération de l'ARN (RNA-Seq) 2-4 alimentée cette approche. Bien que ces technologies ont révolutionné notre compréhension de la complexité de l'expression du gène cellulaire, ils font face à des limitations dues aux propriétés intrinsèques de leur échantillon de modèle, à savoir l'ARN cellulaire total. Premiers changements à court terme des niveaux d'ARN totaux ne correspondent pas à l'évolution des taux de transcription, mais sont intrinsèquement dépendante de l'ARN demi-vie des transcriptions respectifs. Alors qu'une induction cinq fois d'une transcription, par exemple l'encodage de courte durée pour un facteur de transcription, sera facilement détectable dans l'ARN totalmoins d'une heure, le même induction de la transcription, par exemple l'encodage de longue durée pour une enzyme métabolique, restera pratiquement invisible. En outre, même un arrêt complet (> 1000 fois down-regulation) du taux de transcription d'un gène moyenne avec un ARN demi-vie de cinq heures seront simplement prendre cinq heures pour les niveaux d'ARN totaux diminuer de seulement double . Par conséquent, l'analyse de l'ARN totale favorise la détection d'une régulation de la transcription de courte durée, dont la plupart codent pour des facteurs de transcription et des gènes avec des fonctions de réglementation 5. En outre, la vraie cascade cinétique de la réglementation est obscurcie et événements de signalisation primaires ne peut être différenciée du secondaire. Les deux, à son tour, peut entraîner un biais important dans les analyses bioinformatiques aval. Deuxièmement, des modifications dans les niveaux d'ARN totaux ne peuvent pas être attribuées à des changements dans la synthèse d'ARN ou de pourriture. Les mesures de ce dernier nécessitent des approches invasives cellulaires, par exemple blocage transcriptisur l'utilisation de l'actinomycine D 6, et la surveillance prolongée de l'ARN décroissance continue au fil du temps. Avec un ARNm demi-vie moyenne dans les cellules de mammifères de 5 à 10 hr 5,7, les niveaux d'ARNm de la plupart des gènes seulement auront diminué de moins de double après plusieurs heures d'arrêt de la transcription. Ces plutôt petites différences se traduisent en mesures grossièrement imprécise des demi-vies d'ARNm pour la majorité des gènes cellulaires en raison de la nature exponentielle des équations mathématiques sous-jacents. Enfin, si l'ARN-seq de l'ARN cellulaire total a révélé que près de la moitié de nos gènes sont soumis à des événements d'épissage alternatifs 8, la cinétique sous-jacents ainsi que les mécanismes dynamiques directeurs tissus et spécifiques au contexte réglementaire de traitement de l'ARN restent mal compris. En outre, la contribution de l'ARN traitement à l'expression différentielle des gènes, en particulier pour les ARN non-codants, reste à déterminer. Au total, ces limitations représentent des obstacles majeurs pourmodélisation cinétique bioinformatique des mécanismes moléculaires sous-jacents.
Nous avons récemment développé une approche, appelée résolution gène profilage de haute expression, pour surmonter ces problèmes 5,7,9. Il est basé sur le marquage métabolique de l'ARN nouvellement transcrit en utilisant 4 thiouridine (4SU-tagging), un dérivé de l'uridine naturel, et offre un accès direct aux transcriptions nouvellement transcrites avec un minimum d'interférences dans la croissance cellulaire et l'expression des gènes (voir Figure 1) 5, 10-12. L'exposition des cellules eucaryotes aux résultats 4SU à son adoption rapide, la phosphorylation de 4SU-triphosphate, et incorporation dans l'ARN nouvellement transcrites. Après isolement de l'ARN cellulaire total, la fraction d'ARN 4SU-marqué est thiol-spécifique biotinylé à générer un pont disulfure entre la biotine et l'ARN nouvellement transcrites. 'ARN cellulaire total »peuvent ensuite être séparés quantitativement dans étiqueté (' nouvellement transcrit») et sans étiquette («pré-existinG ') d'ARN avec une grande pureté en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Enfin, l'ARN marqué est récupéré à partir des billes par simple addition d'un agent réducteur (par exemple le dithiothréitol) le clivage de la liaison disulfure et de libérer l'ARN nouvellement transcrites à partir des billes.
ARN nouvellement transcrit représente l'activité de transcription de chaque gène au cours de la période d'exposition 4SU. 4SU-tagging dans le calendrier de minutes fournit ainsi un instantané de l'expression des gènes eucaryotes et un modèle idéal pour les analyses bioinformatiques en aval (par exemple, l'analyse du promoteur). Dans les cas où l'état d'équilibre peut supposer, les ratios de nouveaux transcrits / total, nouvellement transcrites / non étiquetés et non étiquetés / ARN total fournissent un accès non-invasive à l'ARN précises des demi-vies 7,13. En outre, il est important de noter que les ARN transcrits nouvellement purifié après aussi peu que 5 min de 4SU-tagging (5 min 4SU-ARN) est plus jeune que 15 et 60 min 4SU-ARN.Lorsque vous effectuez à la fois ultra-court et progressivement plus 4SU-tagging dans un cadre expérimental unique combiné avec l'ARN-Seq, la cinétique de maturation de l'ARN sont révélés à la résolution de nucléotides 9. Enfin, les analyses temps-cours d'ARN nouvellement transcrites et total combiné avec la modélisation informatique permettent une analyse intégrative de la synthèse de l'ARN et de la décomposition 14.
En conclusion, cette approche permet l'analyse directe de la dynamique de la synthèse d'ARN, de la transformation et de la dégradation dans les cellules eucaryotes. Elle est applicable dans tous les grands organismes modèles y compris des mammifères, des insectes (drosophile), les amphibiens (Xenopus) et la levure 5,15,16. Il est directement compatible avec l'analyse des microréseaux 5,17, RNA-Seq 9,13,14, et est applicable in vivo 12,15. Ici, nous détaillons la méthodologie d'étiqueter, d'isoler et de purifier l'ARN nouvellement transcrites dans les cellules de mammifères en culture. En outre, potentiomètreproblèmes al et les pièges sont discutées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le marquage métabolique de l'ARN transcrit nouvellement renforce considérablement la puissance des technologies à haut débit comme des puces et ARN-Seq en fournissant des modèles plus appropriés pour aborder la question biologique d'intérêt. Le présent protocole a subi une optimisation considérable. Il permet l'enrichissement> 1000 fois de l'ARN nouvellement transcrites et fournit des résultats hautement reproductibles.
Le dispositif expérimental d'une exp?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Amie Regan pour la lecture attentive du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NGFN plus de subvention # 01GS0801, MRC bourse subvention G1002523 et NHSBT subvention WP11-05 à LD et DFG subvention FR2938/1-1 au CCF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-thiouridine | Carbosynth | T4509 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze. |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml) | WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C. |
| Chloroform | Sigma | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Isopropanol | Sigma | 650447 | |
| Sodium citrate, nuclease-free | Sigma | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water. |
| 5M nuclease-free NaCl | Sigma | 71386 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma | W4502 | Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes. |
| RNA precipitation buffer | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | ||
| Ethanol | Sigma | 459844 | Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C. |
| 1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| 500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| 10x Biotinylation Buffer (BB) | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml. | ||
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | D4551 | |
| EZ-Link biotin-HPDP | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. |
| Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml | Eppendorf | 0032 005.152 | Optional for the chloroform extraction step. |
| Zeta membrane | BIORAD | 162-0153 | |
| 10x Dot blot binding buffer | 100 mM NaOH, 10 mM EDTA | ||
| Biotin-oligo | 5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence | ||
| Sodium dodecyl sulphate | Fisher | BPE9738 | For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate. |
| EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin | Pierce | 21333 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation. |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 10010-015 | |
| Dot blot blocking buffer | Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM. | ||
| Streptavidin-horseradish peroxidase | Vector Laboratories | SA5004 | Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use. |
| ECL reagent | GE Healthcare | RNP2109 | Use following the manufacturer’s instructions. |
| Super RX, X-RA Film, 18×24 cm | Fujifilm | 47410 19236 | |
| μMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store the beads at 4 °C. |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Washing buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O. | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43817 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use. |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature. |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.692.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72.694.005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified. | |||
| Equipment | |||
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | VWR International | 525-0153 | In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| High-speed rotor | Beckman Coulter | JLA-16250 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Adaptors for 15 ml tubes | Laborgeräte Beranek | 356964 | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g |
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer compact | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 μMacs columns. |
| Waterbath | Grant | SUB Aqua 5 | Or equivalent. |
| Ultra-fine scale | A&D | GR-202 | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
References
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
- Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
- Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
- Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
- Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
- Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
- Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
- Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
- Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
- Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).
- Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).
- Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
- Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
- Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
- Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO – A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).
