Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

Summary

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Abstract

O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma e sequenciamento de próxima geração que revolucionou a nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular. Juntamente com uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos, medições precisas da cinética subjacentes tornaram-se cada vez mais importante. Aqui, essas metodologias poderosas enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas das amostras de modelos que estudam, ou seja, total de RNA celular. Em muitos casos, mudanças de RNA celular total de ocorrer ou muito devagar ou rápido demais para representar os eventos moleculares subjacentes e sua cinética com resolução suficiente. Além disso, a contribuição de alterações na síntese de ARN, o processamento, e da deterioração não são facilmente diferenciados.

Recentemente, desenvolveu perfis de alta resolução expressão gênica para superar essas limitações. A nossa abordagem baseia-se na marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-thiourijante (portanto também designado por 4SU-tagging) seguido por purificação rigorosa do ARN recém transcritos usando biotinilação específica do tiol e as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. A técnica é aplicável a uma ampla gama de organismos, incluindo vertebrados, Drosophila e levedura. Foram aplicados com sucesso 4SU codificação para estudar a cinética em tempo real das actividades de factor de transcrição, proporcionar medições precisas da RNA meia-vida, e obter novos conhecimentos sobre a cinética de processamento do ARN. Finalmente, a modelagem computacional pode ser empregue para gerar uma análise global integrado dos mecanismos moleculares subjacentes.

Introduction

Perfil de expressão gênica é uma ferramenta chave usada para estudar os processos celulares e da rede complexa interação associado. Estudos sobre a abundância de ARNm foram tipicamente o método de escolha para obter conhecimentos básicos sobre os mecanismos moleculares subjacentes. O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma ¹ e, mais recentemente, o sequenciamento de próxima geração de RNA (RNA-seq) ^2-4 alimentou esta abordagem. Embora estas tecnologias revolucionaram nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular, eles enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas de sua amostra do modelo, ou seja, de RNA celular total. Primeiro, as variações a curto prazo nos níveis de ARN total não coincidem alterações nas taxas de transcrição, mas é inerentemente dependente do ARN de semi-vida dos respectivos transcritos. Enquanto uma indução quíntupla de uma transcrição de curta duração, por exemplo, que codifica para um factor de transcrição, serão facilmente detectável no ARN totaldentro de uma hora, a mesma indução de uma transcrição de longa duração, por exemplo, codificação de uma enzima metabólica, ficará praticamente invisível. Além disso, mesmo uma paragem completa (> 1000 vezes down-regulation) na taxa de transcrição de um gene da média com um ARN de semi-vida de cinco horas simplesmente demorar cinco horas para os seus níveis de RNA total de apenas diminuirá duplo . Assim, a análise do RNA total de favorece a detecção de sobre-regulação de transcritos de vida curta, muitos dos quais codificam para factores de transcrição e de genes com funções reguladoras ^5. Além disso, a cascata está obscurecido cinética verdadeira de regulação e os eventos de sinalização primários não pode ser diferenciado do secundário. Ambos, por sua vez, pode resultar em viés substancial nas análises a jusante da bioinformática. Em segundo lugar, as alterações nos níveis de ARN total não pode ser atribuída a alterações na síntese de RNA ou deterioração. Medidas deste último requer abordagens invasivos de células, por exemplo, bloqueadores transcriptisobre o uso de actinomicina D ^6, e monitorização da deterioração contínua estendida ao longo do tempo de RNA. Com um ARNm de semi-vida média das células de mamífero de 5 – 10 horas ^5,7, níveis de ARNm da maioria dos genes somente terão diminuído de menos de duas vezes após várias horas de detenção transcripcional. Estas diferenças relativamente pequenas resultar em medições grosseiramente imprecisas de ARNm de semi-vida para a maioria dos genes celulares, devido à natureza exponencial das equações matemáticas subjacentes. Finalmente, enquanto que o RNA-seq de ARN celular total mostrou que aproximadamente metade dos nossos genes estão sujeitos a eventos de splicing alternativos ^8, a cinética subjacentes, bem como os mecanismos dinâmicos orientadores de tecidos e específicos de regulação do contexto de processamento de ARN permanecem pouco compreendidos. Além disso, a contribuição de processamento do RNA para a expressão diferencial de genes, em particular para RNAs não-codificantes, permanece a ser determinada. Ao todo, estas limitações representam grandes obstáculos paramodelagem cinética bioinformática dos mecanismos moleculares subjacentes.

Recentemente, desenvolveu uma abordagem, o perfil de expressão do gene denominado de alta resolução, para ultrapassar estes problemas ^5,7,9. Baseia-se na marcação metabólica de RNA recém transcrito usando 4 tiouridina (4SU-tagging), um derivado uridina que ocorre naturalmente, e oferece acesso directo às transcrições recém-transcritos com o mínimo de interferência no crescimento celular e expressão gênica (ver Figura 1) ^{5, 10-12.} A exposição das células eucarióticas a resultados 4SU na sua absorção rápida, a fosforilação de 4SU-trifosfato, e incorporação de RNA recentemente transcrito. Após isolamento do RNA celular total, a fracção de ARN marcado é 4SU-tiol especificamente biotinilados gerar uma ligação de dissulfureto entre a biotina e os transcritos de RNA recentemente. "Total RNA celular", então pode ser quantitativamente separados em rotulada ('recentemente transcrito') e não marcado ("pré-existing ') ARN com elevado grau de pureza usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Finalmente, o ARN marcado é recuperado a partir das pérolas por simples adição de um agente redutor (por exemplo ditiotreitol) a clivagem da ligação dissulfureto e libertação do ARN recém transcritos a partir das pérolas.

RNA recém transcrito retrata a atividade transcricional de cada gene, durante o período de exposição 4SU. 4SU-tagging na escala de tempo de minutos, portanto, fornece um retrato instantâneo da expressão gênica eucariótica e um modelo ideal para a jusante análises de bioinformática (por exemplo, análise de promotor). Nos casos em que as condições de estado estacionário pode ser assumidas, os índices de recém-transcrita / total, o recém-transcrito / sem rótulo e sem rótulo / RNA total de proporcionar o acesso não-invasivo para RNA precisos meia-vida ^7,13. Além disso, é importante notar que os transcritos de RNA recentemente purificados após tão pouco como 5 minutos de 4SU-marcação (5 min 4SU-RNA) é menor que 15 e 60 min 4SU-RNA.Ao realizar tanto ultra-curtos e progressivamente mais 4SU-tagging em uma única configuração experimental combinado com RNA-seq, a cinética de processamento de RNA são revelados na resolução de nucleotídeos ^9. Finalmente, as análises de curso de tempo de RNA recém transcrito e total combinado com modelagem computacional permitem uma análise integrativa da síntese de RNA e decadência ^14.

Em conclusão, esta abordagem permite a análise direta da dinâmica da síntese de RNA, processamento e degradação em células eucarióticas. É aplicável em todos os principais organismos modelo, incluindo mamíferos, insetos (Drosophila), anfíbios (Xenopus) e levedura ^5,15,16. Ele é diretamente compatível com a análise de microarray ^5,17, RNA-seq ^9,13,14, e é aplicável in vivo ^12,15. Aqui, vamos detalhar a metodologia de rotular, isolar e purificar RNA recém transcrito em células de mamíferos cultivadas. Além disso, potenciomêtroproblemas ai e armadilhas são discutidos.

Protocol

1. Marcação metabólica com 4-tiouridina Faça um plano detalhado da instalação experimental / programação, por exemplo, quando adicionar o 4SU para cultura de células e quando a colheita das amostras. Plano de pelo menos 5 minutos entre cada condição. Apenas o tratamento de células de uma condição de cada vez. Lidar com máx. 3-5 pratos em um determinado momento. Pega células tão rapidamente quanto possível, para minimizar as alterações nos níveis de temperatura e d…

Representative Results

1. Material de Partida e os rendimentos esperados Após 1 hora (hr) de 4SU-exposição de RNA recentemente transcrito representa cerca de 1-4% do RNA celular total. Esta será mais baixa em células de crescimento a ser preso em que já não conta para sintetizar o RNA para o crescimento celular / replicação. Quando a rotulagem por 1 hr, recomendamos iniciar o ensaio com 60-80 mg de RNA total. Começando com menos de 30 ug de RNA total de resultados em peletes pequenas de RNA que são difíce…

Discussion

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita aumenta substancialmente o poder das tecnologias de alto rendimento, como microarrays e RNA-seq, fornecendo modelos mais adequados para lidar com a questão biológica de interesse. O presente protocolo foi extensivamente otimização. Ele permite o enriquecimento> 1.000 vezes maior de RNA recentemente transcrito e proporciona resultados altamente reprodutíveis.

O delineamento experimental do experimento 4SU-tagging é de crucial importânc…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-thiouridine	Carbosynth	T4509	Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 °C in aliquots of 50-500 μl, discard unused reagent, do not refreeze.
Trizol	Invitrogen	15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)	WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 °C.
Chloroform	Sigma	372978	WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Isopropanol	Sigma	650447
Sodium citrate, nuclease-free	Sigma	C8532	Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.
5M nuclease-free NaCl	Sigma	71386	Stock solution
Nuclease-free H2O	Sigma	W4502	Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.
RNA precipitation buffer			1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Ethanol	Sigma	459844	Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 °C.
1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5	Lonza	51237	Stock solution
500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-020	Stock solution
10x Biotinylation Buffer (BB)			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link biotin-HPDP	Pierce	21341	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml	Eppendorf	0032 005.152	Optional for the chloroform extraction step.
Zeta membrane	BIORAD	162-0153
10x Dot blot binding buffer			100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo			5′-biotin, 25 nucleotides, any sequence
Sodium dodecyl sulphate	Fisher	BPE9738	For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 °C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin	Pierce	21333	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 °C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.
Phosphate buffer saline	Gibco	10010-015
Dot blot blocking buffer			Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.
Streptavidin-horseradish peroxidase	Vector Laboratories	SA5004	Store at -20 °C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 μl Streptavidin-HRP before use.
ECL reagent	GE Healthcare	RNP2109	Use following the manufacturer’s instructions.
Super RX, X-RA Film, 18×24 cm	Fujifilm	47410 19236
μMacs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	Store the beads at 4 °C.
Tween 20	Sigma	P1379
Washing buffer			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	43817	Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	Store columns at 4 °C, remaining components of the kit at room temperature.
1.5 ml screw-top polypropylene tubes	Sarstedt	72.692.005	Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes	Sarstedt	72.694.005	Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes	BD Falcon	352096	Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes	BD Falcon	352070	Compatible with Dimethylformamide
			All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.
			Equipment
UV/VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	Or equivalent. Use low volume (1-2 μl) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes	VWR International	525-0153	In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 × g
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25	Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
High-speed rotor	Beckman Coulter	JLA-16250	Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
Adaptors for 15 ml tubes	Laborgeräte Beranek	356964	Or equivalent equipment capable of reaching 13,000×g
Refrigerated table-top centrifuge	Eppendorf	5430 R	Or equivalent.
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer compact	Or equivalent.
Magnetic stand	Miltenyi Biotec	130-042-109	One stand holds 8 μMacs columns.
Waterbath	Grant	SUB Aqua 5	Or equivalent.
Ultra-fine scale	A&D	GR-202	Or equivalent.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels	Invitrogen	G4020-01	For RNA gels; or equivalent.