سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية
Summary
يمكن أن تكون الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية كعلاج استبدال خلية لشكل متقدمة من الجفاف المرتبطة بالسن البقعي. ويصف هذا البروتوكول توليد نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية وزرع الخلايا الظهارية الإنسان صبغة الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية سوبريتينال إلى هذا النموذج من المرض.
Abstract
ضمور الجغرافية (GA)، مرحلة متأخرة من الجافة المرتبطة بالسن البقعي تتسم بفقدان طبقة (RPE) الظهارية الصبغية الشبكية، الأمر الذي يؤدي إلى انحطاط اللاحقة للهياكل الشبكية الحيوية (مثلاً، فوتوريسيبتورس) مما تسبب في ضعف الرؤية حادة. وبالمثل، RPE-الخسارة وانخفاض في حدة البصر هو ينظر في المتابعة طويلة الأجل عن مرضى المتقدمة الرطب المرتبطة بالسن البقعي (AMD) يتلقون العلاج حقن الأوعية الدموية المضادة عامل نمو غشائي (VEGF). ولذلك، من ناحية، أنه أمر أساسي لكفاءة استخلاص الخلايا RPE من مصدر غير محدود يمكن أن تستخدم كعلاج بديل. من ناحية أخرى، من المهم تقييم السلوك ودمج الخلايا المشتقة في نموذج تستتبع الأمراض الجراحية وأساليب التصوير كقريبة قدر الإمكان من تلك المطبقة في البشر. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل استناداً إلى المنشورات السابقة التي تصف توليد نموذج الإكلينيكية للجمعية العامة استخدام العين أرنب ألبينو، لتقييم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستمدة من الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (هيس-RPE) في الإعداد ذات الصلة سريرياً. RPE هيس متباينة يتم زرعها في عيون ساذجة أو العيون مع نيو3-الناجم عن تنكس الشبكية GA-مثل استخدام تقنية بلانا بارس ترانسفيتريل ز 25. تقييم للمناطق المزروعة وتحولت يؤديها المتعدد الوسائط عالي الدقة من التصوير في الوقت الحقيقي غير الغازية.
Introduction
ويصف هذا البروتوكول توليد نموذج السريرية كبيرة العينين من ضمور الجغرافية (GA) التي تتيح تقييم إدماج RPE هيس المزروعة في الفضاء سوبريتينال. وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا بالتفصيل 3 المنشورات الأخيرة التي تثبت إنتاج السكان المخصب ونقية والوظيفية للخلايا RPE من هيس1، فضلا عن خلق تلف الشبكية الخارجي والنمط الظاهري مثل GA الناجم عن حقن سوبريتينال لحلول الملح الفسيولوجي (أي، BSS وبرنامج تلفزيوني) أو نيو3 في أرنب العين2،3. كذلك أثبتنا أن تشكل عمليات زرع الشبكية دون تعليق من RPE هيس مونولاييرس وظيفية واسعة النطاق مع مستقبله الإنقاذ قدرة2.
مرافقة عدة مزايا استخدام العين أرنب لتوليد نموذج ألجأ للمرض. أولاً، الحجم العين الأرانب، والذي هو 70% حجم العين البشرية الكبار، يسمح زرع سريرياً ذات مغزى استخدام كثافة خلية التي أقل بكثير مما يستخدم عادة في عيون القوارض الصغيرة (1,000 الخلايا/ميليلتر مقابل 50,000 الخلايا/ميليلتر)4 , 5-وثانيا، عملية جراحية في القوارض هو عادة ترانسكليرال عبر المشيمية، مما يهدد الجدار الشبكية، ويحتمل أن يؤدي استجابة تحريضية و رفض ممكن6. هذان العاملان معا قد يؤدي إلى مولتيلاييرينج والتثاقل زرع الخلايا، ودمج الخلايا المزروعة في نسيج شبكية أصلية تعطل فقراء عموما. ومع ذلك، يسمح نموذج أرنب كبير العينين أداء تقنية جراحية مع الأجهزة مطابقة لإعداد سريرية. وثالثاً، نموذج كبير العينين أيضا تصاريح ذات الدقة العالية في فيفو التصوير ورصد الخلايا المزروعة والشبكية السطحية من خلال الساعة1،،من23. وهكذا يصف لنا نموذج السريرية ذات الصلة سريرياً وفعالة من حيث التكلفة التي ينبغي أن تكون بديلاً جذاباً للقوارض لأي شخص لديه مصلحة في البحوث الشبكية المريضة وطبيعية والمساحة الشبكية الفرعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد في هذا البروتوكول، وتوليد نموذج كبير العينين GA واستخدامها الإكلينيكية لتقييم RPE هيس التكامل في فيفو .
لترجمة العلاجات التجديدي للجمعية العامة والأمراض ذات الصلة إلى عيادة7، من المهم تطوير وتحسين الأساليب التي صدق التقاط الطرق السريرية لزرع الأعضاء و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كانت تدعمها المنح المقدمة من معهد كارولينسكا، مؤسسة مارغريتا الأميرة للمكفوفين، مؤسسة الأردن إدوين لبحوث طب العيون، ومؤسسة العين السويدية، مؤسسة الملك جوستاف الخامس، في أرميك مؤسسة ليندبيرج، ومؤسسة كرونقفيست.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
