Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie
Summary
Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.
Abstract
Geografische atrofie (GA), het late stadium van droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie wordt gekenmerkt door verlies van de retinale pigment epitheliale (RPE) laag, die tot verdere ontaarding van vitale retinale structuren (bijvoorbeeld, researchdieren leidt) veroorzaken ernstige visie bijzondere waardevermindering. Evenzo wordt RPE-verlies en daling van de gezichtsscherpte gezien in de lange termijn volgen omhoog van patiënten met geavanceerde natte leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (LMD) die intravitreal anti-vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) behandeling. Dus, aan de ene kant, het is van fundamenteel belang voor het efficiënt afleiden RPE cellen uit een oneindige bron, die als substitutietherapie dienen kunnen. Aan de andere kant, het is belangrijk om te evalueren van het gedrag en de integratie van de afgeleide cellen in een model van de ziekte met als gevolg dat chirurgische en beeldvormende methoden als dicht mogelijk bij die worden toegepast bij de mens. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol op basis van onze eerdere publicaties die beschrijft de generatie van een preklinische model voor GA met behulp van het albino konijn oog, voor de evaluatie van de menselijke embryonale stamcellen afgeleid retinale pigment epitheliale cellen (hESC-RPE) in een klinisch relevante instelling. Gedifferentieerde hESC-RPE in naïef ogen of ogen met NaIO3worden getransplanteerd-geïnduceerde GA-achtige Retina degeneratie met behulp van een techniek met 25 G transvitreal pars plana. Beoordeling van gedegenereerd en getransplanteerde gebieden is uitgevoerd door multimodale high-resolution niet-invasieve real-time imaging.
Introduction
Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed preklinische model van geografische atrofie (GA), waarmee de evaluatie van de integratie van getransplanteerde hESC-RPE in de subretinal ruimte. De in detail hier beschreven methoden zijn gebruikt in 3 recente publicaties die aantonen de productie van een verrijkte, zuivere en functionele bevolking van RPE cellen van hESC1, evenals de oprichting van buitenste retinale schade en een GA-achtige fenotype dat veroorzaakt door subretinal injectie van fysiologische zoutoplossingen (d.w.z., BSS en PBS) of NaIO3 in de konijn eye2,3. We verder aangetoond dat sub retinale schorsing transplantaties van hESC-RPE uitgebreide functionele monolayers met fotoreceptor redding capaciteit2vormen.
Verschillende voordelen vergezeld gaan van het gebruik van het konijn-oog voor de generatie van een GA model van ziekte. Ten eerste, de grootte van het konijn oog, die is 70% van het volume van een volwassen menselijk oog, kan klinisch zinvolle transplantatie met behulp van een celdichtheid die veel lager is dan routinematig gebruikt in kleine knaagdieren ogen (1000 cellen/µL vs. 50.000 cellen/µL)4 , 5. ten tweede chirurgie bij knaagdieren is meestal transscleral via het vaatvlies, die het netvlies barrière in het gedrang brengt en potentieel triggers een ontstekingsreactie en een mogelijke afwijzing6. Beide factoren leiden samen tot multilayering en samendoen van getransplanteerde cellen, en een over het algemeen slechte integratie van de getransplanteerde cellen in een verstoorde inheemse retinale weefsel. Echter kunt het grote-eyed konijn model uitvoeren van een chirurgische techniek met instrumentatie identiek aan een klinische setting. Ten derde, een grote-eyed model tevens in staat hoge resolutie in vivo imaging en bewaking van de getransplanteerde cellen en het bovenliggende netvlies door tijd1,2,3. Dus beschrijven we een klinisch relevante en kosten-efficiënte preklinische model dat een aantrekkelijk alternatief voor knaagdieren voor iedereen met een interesse in onderzoek van het netvlies van normale en zieke en de sub retinale ruimte moet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol, wordt de generatie van een grote-eyed model van GA en het preklinische gebruik voor het evalueren van hESC-RPE integratie in vivo beschreven.
Vertaling van regeneratieve therapieën voor GA en de verwante ziekten in de kliniek7is het belangrijk te ontwikkelen en optimaliseren van methoden die getrouw de klinische methoden voor transplantatie en beeldbewerking vangen. Het konijn is in dit aantrekkelijke aspect: het heeft een relatief grote oog d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Karolinska Instituut, het kroonprinses Margareta van Stichting voor de slechtzienden, de Stichting Jordanië Edwin voor uitgevoerd oftalmologisch onderzoek, de Zweedse Eye Foundation, de koning Gustav V Foundation, de ARMEC Lindeberg Foundation, en de Cronqvist Foundation.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
