השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית
Summary
תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.
Abstract
אטרופיה גיאוגרפית (ג’י אי), בשלב מאוחר של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש מאופיין על ידי אובדן הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) השכבה, מה שמוביל ניוון עוקבות של מבנים חיוניים ברשתית (למשל, photoreceptors) גורם ליקוי ראייה חמור. באופן דומה, RPE- ואובדן של ירידה חדות הראייה נתפסת ב מעקב ארוך טווח למעלה של חולים עם מתקדמות הקשורות לגיל ניוון מקולרי רטוב (AMD) טיפול אנטי-כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) intravitreal. לכן, מצד אחד, זה היסוד להפיק ביעילות תאי RPE ממקור בלתי מוגבל העשויה לשמש כטיפול חלופי. מצד שני, זה חשוב להעריך את התנהגות ושילוב של התאים נגזר במודל של המחלה פרוגרמה כירורגי, שיטות הדמיה כמו קרוב ככל האפשר לאלה חלה אצל בני אדם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המבוסס על פרסומים קודמים המתארת את הדור של דגם פרה של GA באמצעות העין ארנב לבקן, עבור הערכה של תאי גזע עובריים אדם נגזר בתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (hESC-RPE) ב ההגדרה הרלוונטית קלינית. HESC הבדיל-RPE מושתלים לתוך העיניים תמים או עיניים עם NaIO3-induced GA כמו ניוון הרשתית בטכניקה 25 גרם transvitreal pars plana. הערכה של אזורי מנוונת המושתלים מתבצע על ידי עם מודאלים מרובים ברזולוציה גבוהה הדמיה בזמן אמת לא פולשנית.
Introduction
פרוטוקול זה מתאר את הדור של דגם פרה עם עיניים גדולות של אטרופיה גיאוגרפית (ג’י אי) המאפשר את ההערכה של אינטגרציה של hESC-RPE המושתלים במרחב subretinal. השתמשו בשיטות המתוארות כאן בפירוט בפרסומים האחרונים 3 הממחישים את הייצור של אוכלוסיה מועשר, טהור, פונקציונלי תאי RPE hESC1, כמו גם היצירה של נזק הרשתית החיצונית הפנוטיפ GA דמוי המושרה על ידי הזרקה subretinal של פתרונות מלח הפיזיולוגיות (קרי, BSS ו- PBS) או NaIO3 הארנב עיניים2,3. אנחנו עוד הוכיח כי ההשעיה תת ברשתית השתלות של hESC-RPE טופס monolayers תפקודית מקיפה עם קולט אור הצלה קיבולת2.
מספר יתרונות מלווים את השימוש של העין ארנב לדור של דגם GA של המחלה. קודם כל, הגודל של העין ארנב, אשר הוא 70% הנפח של עין אנושיים בוגרים, מאפשר השתלת משמעותיים קלינית באמצעות צפיפות התאים כי הוא נמוך בהרבה מאשר בשימוש שגרתי עיניים קטנות מכרסמים (1,000 תאים/µL נ’ 50,000 תאים/µL)4 , 5. שנית, ניתוח בחולדות הוא בדרך כלל transscleral דרך דמית, אשר פוגעת המכשול ברשתית, שעשוי להיות מפעיל לתגובה דלקתית, דחייה אפשרית6. שני גורמים ביחד עלול להוביל multilayering הצליעה של התאים המושתלים, ושילוב כללי ירוד של התאים המושתלים ברקמת הרשתית יליד שיבשו. עם זאת, המודל ארנב גדול-עיניים מאפשר ביצוע טכניקה כירורגית עם מכשור זהה להגדרה הקלינית. שלישית, מודל עם עיניים גדולות מאפשרת גם ברזולוציה גבוהה ויוו הדמיה וניטור של התאים המושתלים, הרשתית שמעליה עד זמן1,2,3. לפיכך, אנו מתארים דגם פרה קליניות הרלוונטיים, חסכוניים שאמורים להיות חלופה אטרקטיבית מכרסמים לכל בעל עניין במחקר של הרשתית נורמלי וחולים ובשטח תת ברשתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, מתואר הדור של מודל גדול-עיניים של GA ושימוש בו פרה להערכת hESC-RPE אינטגרציה ויוו .
לתרגום של טיפולים משובי עבור GA ומחלות קשורות לתוך המרפאה7, חשוב לפתח, לייעל שיטות בנאמנות ללכוד שיטות קליניות השתלת והדמיה. הארנב הוא בהיבט הזה אטרקטיבי: יש לו עין ג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממכון קרולינסקה הרישמי של Margareta נסיכת הכתר לקויי ראייה, הקרן ירדן אדווין מחקר Ophthalmological, קרן עין שוודית, קרן המלך גוסטב החמישי, את ARMEC Lindeberg קרן, קרן cronqvist ב.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
