Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed
Summary
Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.
Abstract
Atrofia geografica (GA), la fine della fase di degenerazione maculare senile secca è caratterizzata da perdita dello strato del pigmento retinico epiteliale (RPE), che conduce a degenerazione successiva delle strutture retiniche vitali (ad es., fotorecettori) causando gravi problemi visivi. Allo stesso modo, perdita di RPE e diminuzione dell’acuità visiva è visto in seguito a lungo termine di pazienti con avanzato wet età degenerazione maculare senile (AMD) trattati intravitreale anti-vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF). Pertanto, da un lato, è fondamentale in modo efficiente derivare cellule RPE da una fonte illimitata che potrebbe servire come terapia sostitutiva. D’altra parte, è importante valutare il comportamento e l’integrazione delle cellule derivate in un modello della malattia che comportano chirurgica e metodi di imaging come vicino possibile a quelle applicate negli esseri umani. Qui, forniamo un dettagliato protocollo basato su nostre pubblicazioni precedenti che descrive la generazione di un modello preclinico di GA utilizzando l’occhio di coniglio albino, per valutazione della cellula staminale embrionale umana derivate cellule epiteliali del pigmento retinico (hESC-RPE) in un impostazione clinicamente rilevante. Differenziato hESC-RPE sono trapiantate in occhi ingenui o con NaIO3-indotto GA-come degenerazione retinica utilizzando una tecnica di 25 G transvitreal pars plana. Valutazione delle zone degenerate e trapiantati viene effettuata da multimodale ad alta risoluzione imaging non-invasivo in tempo reale.
Introduction
Questo protocollo descrive la generazione di un modello preclinico dagli occhi grandi di atrofia geografica (GA) che permette la valutazione dell’integrazione dei trapiantati hESC-RPE nello spazio subretinal. I metodi descritti in dettaglio qui sono stati utilizzati in 3 pubblicazioni recenti che illustrano la produzione di una popolazione arricchita, pura e funzionale di cellule RPE da hESC1, come pure la creazione di danno retinico esterno e un fenotipo simile a GA indotto tramite l’iniezione subretinal di soluzioni saline fisiologiche (cioè, BSS e PBS) o NaIO3 , occhio del coniglio2,3. Abbiamo ulteriormente dimostrato che trapianti di sospensione sub-retinico di hESC-RPE formano monostrati vasti funzionali con fotorecettore soccorso capacità2.
Diversi vantaggi accompagnano l’uso dell’occhio di coniglio per la generazione di un modello di GA di malattia. In primo luogo, la dimensione dell’occhio di coniglio, che è del 70% il volume di un occhio umano adulto, consente il trapianto clinicamente significativo usando una densità di cella che è molto inferiore di quanto abitualmente utilizzati per occhi piccoli roditori (1.000 cellule / µ l vs 50.000 cellule / µ l)4 , 5. in secondo luogo, chirurgia nei roditori è di solito transscleral attraverso la coroide, che compromette la barriera della retina e potenzialmente attiva una risposta infiammatoria e un eventuale rifiuto6. Entrambi fattori insieme possono portare a multilayering e aggregazione delle cellule trapiantate e un’integrazione nel complesso scadente delle cellule trapiantate in un tessuto retinico nativo perturbato. Tuttavia, il modello di coniglio dagli occhi grandi consente di effettuare una tecnica chirurgica con strumentazione identica a una regolazione clinica. In terzo luogo, un modello di grandi dimensioni-eyed consente anche ad alta risoluzione in vivo imaging e monitoraggio delle cellule trapiantate e la retina sovrastante attraverso tempo1,2,3. Così, descriviamo un modello preclinico clinicamente rilevante e costo-efficiente che dovrebbe essere un’alternativa attraente ai roditori per chiunque con un interesse nella ricerca della retina normale e malata e lo spazio sub-retinico.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, la generazione di un modello di grandi occhi di GA e suo uso preclinico per valutare hESC-RPE integrazione in vivo è descritto.
Per la traduzione di terapie rigenerative per GA e malattie correlate nella clinica7, è importante sviluppare e ottimizzare metodi che acquisire fedelmente i metodi clinici per trapianto e di imaging. Il coniglio è in questo aspetto attraente: ha un occhio relativamente grande che permette l’ambulatorio intraoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Karolinska Institute, Fondazione della Crown Princess Margareta per i non vedenti, la Fondazione di Jordan Edwin per ricerca oftalmologica, la Fondazione svedese di occhio, il re Gustav V Foundation, la ARMEC Fondazione di Lindeberg e la Fondazione di Cronqvist.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
