Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica
Summary
Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.
Abstract
Atrofia geográfica (GA), la última etapa de degeneración macular seca relacionada con la edad se caracteriza por la pérdida de la capa de (RPE) epitelial del pigmento retiniano, que conduce a la degeneración subsecuente de estructuras vitales de la retinales (e.g., fotorreceptores) causando debilitación severa de la visión. Del mismo modo, RPE-pérdida y disminución de la agudeza visual se ve en el seguimiento a largo plazo a de pacientes con avanzada degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) que reciben tratamiento de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) intravítreos. Por lo tanto, por un lado, es fundamental para derivar eficazmente las células RPE de una fuente ilimitada que podría servir como terapia de reemplazo. Por otro lado, es importante evaluar el comportamiento y la integración de las células derivadas de un modelo de la enfermedad que implique quirúrgicas y métodos de imagen como cerrar como sea posible a las que se aplican en los seres humanos. Presentamos un protocolo detallado basado en nuestras publicaciones anteriores que describe la generación de un modelo preclínico de GA con el ojo de conejo albino, para la evaluación de las células madre embrionarias derivadas de las células epiteliales del pigmento retiniano (hESC-RPE) en un ajuste clínicamente relevante. Células diferenciada-RPE son transplantadas en ojos de ingenuo o con NaIO3-inducida por GA-como la degeneración retiniana con técnica 25 G transvitreal pars plana. Se realiza evaluación de zonas degeneradas y trasplantadas por multimodal proyección en tiempo real de imagen no invasiva alta resolución.
Introduction
Este protocolo describe la generación de un modelo preclínico de grandes ojos de atrofia geográfica (GA) que permite la evaluación de la integración de células transplantada-RPE en el espacio subretinal. Se han utilizado los métodos descritos en detalle aquí en 3 publicaciones recientes que demuestran la producción de una población enriquecida, pura y funcional de las células RPE de hESCs1, así como la creación de daño retiniano externo y un GA-como fenotipo inducida por la inyección subretinal de soluciones salinas fisiológicas (es decir, BSS y PBS) o NaIO3 en el conejo ojo2,3. Hemos demostrado además que trasplantes de sub-retinal de la suspensión de células RPE forman monocapas funcionales extensa con fotorreceptor rescate capacidad2.
Varias ventajas acompañarán el uso del ojo del conejo para la generación de un modelo de GA de la enfermedad. En primer lugar, el tamaño del ojo del conejo, que es el 70% del volumen de un ojo humano adulto, permite trasplante clínicamente significativo con una densidad celular que es mucho más baja que utiliza habitualmente en ojos pequeños roedores (1.000 células/μl frente a 50.000 células/μl)4 , 5. en segundo lugar, la cirugía en roedores suele transscleral a través de la coroides, que compromete la barrera retiniana y potencialmente desencadena una respuesta inflamatoria y un posible rechazo6. Ambos factores juntos pueden conducir a multilayering y aglutinación de las células trasplantadas y una integración general deficiente de las células trasplantadas en un tejido retiniano nativa interrumpido. Sin embargo, el modelo de conejo grande-eyed permite la realización de una técnica quirúrgica con instrumentación idéntica a un ajuste clínico. En tercer lugar, un modelo de grandes ojos también permite alta resolución en vivo la proyección de imagen y control de las células trasplantadas y la retina suprayacente al tiempo1,2,3. Así, describimos un modelo preclínico clínico relevante y rentable que debe ser una alternativa atractiva a los roedores para cualquier persona con un interés en la investigación de la retina normal y enferma y el espacio sub-retinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe la generación de un modelo de grandes ojos de AG y su uso preclínico para evaluar la integración de células RPE en vivo .
Para la traducción de terapias regenerativas para GA y enfermedades relacionadas en la clínica7, es importante desarrollar y optimizar métodos que reflejan fielmente los métodos clínicos para el trasplante y la proyección de imagen. El conejo es en este aspecto atractivo: tiene un ojo relativamente gr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por becas del Instituto Karolinska, Fundación del Crown Princess Margareta para invidentes, la Fundación de investigación oftalmológica, el rey Gustav V Foundation, la Fundación sueca de ojo, el ARMEC Edwin Jordan Fundación de Lindeberg y la Fundación Cronqvist.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
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