Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie
Summary
Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.
Abstract
Geografischen Atrophie (GA), die späte Phase der trockene altersbedingte Makuladegeneration zeichnet sich durch Verlust der retinalen Pigment (RPE) Epithelschicht, führt zu einer nachfolgenden Degeneration des lebenswichtigen retinalen Strukturen (z.B. Photorezeptoren) verursacht schwere Sehbehinderung. Ebenso ist RPE-Verlust und Abnahme der Sehschärfe in langfristigen Folgen oben gesehen von Patienten mit fortgeschrittenen Feuchte altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die intravitreale Anti-vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) Behandlung. Daher ist es auf der einen Seite grundlegende effizient RPE-Zellen aus einer unbegrenzten Quelle abgeleitet, die als Ersatz-Therapie dienen könnte. Auf der anderen Seite, es ist wichtig, das Verhalten und die Integration der abgeleiteten Zellen in einem Modell der Krankheit mit chirurgischen bewerten und bildgebende Verfahren wie nah wie möglich an die beim Menschen angewendet. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll basierend auf unseren bisherigen Veröffentlichungen, die die Generation der präklinischen Modell GA beschreibt mit Albino Kaninchenauge für Bewertung der menschlichen embryonalen Stammzellen retinalen Pigment Epithelzellen (hESC-RPE) abgeleitet in eine klinisch relevante Einstellung. Differenzierte hESC-RPE werden verpflanzt in naiven Augen oder mit NaIO3-GA-Like Netzhautdegeneration mit einer 25 G Transvitreal Pars Plana Technik induziert. Bewertung der degenerierten und transplantierten Gebieten erfolgt durch multimodale hochauflösende nichtinvasive Echtzeit-Bildgebung.
Introduction
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen präklinischen Modell der geografischen Atrophie (GA), die die Auswertung der Integration von transplantierten hESC-RPE in den subretinalen Raum ermöglicht. Die hier ausführlich beschriebenen Methoden wurden in 3 neueren Publikationen verwendet, die die Produktion einer angereicherten, rein und funktionale Bevölkerung von RPE-Zellen aus hESC1sowie die Schaffung der äußeren Netzhaut Schaden und ein GA-ähnlichen Phänotyp zeigen induziert durch die subretinale Injektion von physiologischen Salzlösungen (d.h., BSS und PBS) oder NaIO3 im Kaninchen Auge2,3. Wir zeigten weiter, dass subretinalen Aussetzung Transplantationen von hESC-RPE umfangreiche funktionale Monolagen mit Photorezeptor Rettung Kapazität2 bilden.
Mehrere Vorteile begleiten den Einsatz von Kaninchenauge zur Erzeugung von einem GA-Modell der Krankheit. Erstens, die Größe der Kaninchenauge, die 70 % das Volumen eines Erwachsenen menschlichen Auges, können klinisch bedeutsamen Transplantation mit einer Zelldichte, die viel niedriger als in kleinen Nagetier Augen (1.000 Zellen/µL vs. 50.000 Zellen/µL)4 routinemäßig eingesetzt , 5. Zweitens Chirurgie bei Nagetieren ist in der Regel Transscleral durch die Aderhaut, die Kompromisse der retinalen-Schranke und potenziell löst eine Entzündungsreaktion und eine mögliche Ablehnung-6. Beide Faktoren können zu Ölpauseverfahren und Verklumpung der transplantierten Zellen und einer insgesamt schlechten Integration der transplantierten Zellen in einem gestörten native Netzhautgewebe zusammen führen. Die großen Augen Kaninchen-Modell ermöglicht jedoch eine Operationstechnik mit Instrumentierung identisch mit einer klinischen Umgebung durchführen. Drittens ermöglicht eine große-Augen-Modell auch mit hoher Auflösung in Vivo imaging und Überwachung der transplantierten Zellen und der darüberliegenden Netzhaut durch Zeit1,2,3. So beschreiben wir eine klinisch relevante und kosteneffiziente präklinische Modell, die eine attraktive Alternative zu Nagetiere für jedermann mit einem Interesse in der Forschung der normalen und krankhaften Netzhaut und subretinalen Raum sein sollte.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll wird die Generation eines großen Augen Modells der GA und den präklinischen Einsatz für die Bewertung der hESC-RPE Integration in Vivo beschrieben.
Für die Übersetzung der regenerative Therapien für GA und damit verbundenen Krankheiten in die Klinik-7ist es wichtig, Entwicklung und Optimierung von Methoden, die die klinischen Methoden für Transplantation und Imaging treu zu erfassen. Das Kaninchen ist in dieser Hinsicht attraktiv: Es …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Karolinska-Institut, die Kronprinzessin Margareta Stiftung für Sehgeschädigte, Edwin Jordan Foundation für ophthalmologische Forschung, die schwedische Eye Foundation, der König Gustav V Foundation, der ARMEC Lindeberg Stiftung und die Stiftung Cronqvist.
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
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