我们展示了一种基于精子细胞核形态来判断受精成功或失败的方法 拟南芥 使用落射荧光显微镜观察双受精过程。
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摘要
摘要
开花植物具有一种独特的有性生殖系统，称为“双受精”， 其中每个精子细胞精确地与一个卵细胞或一个中央细胞融合，因此几乎同时发生两次独立的受精事件。受精后的卵细胞和中央细胞分别发育为合子和胚乳。因此，对双受精过程的精确调控对于后续的种子发育至关重要。双受精发生在雌配子体（胚囊）中，而雌配子体深藏于厚实的胚珠和子房组织内部。这种雌蕊组织结构使得对双受精的观察与分析极为困难，导致目前关于双受精机制的许多问题仍未得到解答。对于潜在受精调控因子的功能评估，受精表型的分析至关重要。在判断拟南芥（Arabidopsis thaliana）中受精是否完成时，通常以标记精子细胞核的荧光信号形态作为指标。未能成功受精的精子细胞表现为在雌配子体外出现凝聚的荧光信号，而成功受精的精子细胞则因与雌配子体细胞核发生核融合而呈现去凝聚的荧光信号。本文所述方法提供了一种在活体条件下判断受精成功或失败的有效工具。
引言
开花植物通过双受精产生种子，该过程直接受定位于配子质膜上的蛋白质之间相互作用的调控1,2。开花植物的雄性配子为一对精细胞，发育于花粉中。授粉后，花粉管生长并将这对精细胞递送至位于胚囊中的雌性配子——卵细胞和中央细胞。当雄性和雌性配子相遇后，配子表面的蛋白质促进识别、黏附和融合，从而完成双受精过程。在以往的研究中，已鉴定出雄性配子膜蛋白GENERATIVE CELL SPECIFIC 1（GCS1）/HAPLESS2（HAP2）3,4和GAMETE EXPRESSED 2（GEX2）5分别为参与配子融合和黏附的受精调控因子。我们近期鉴定出一种雄性配子特异性的膜蛋白DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9（DMP9），其参与配子相互作用并作为受精调控因子。研究发现，DMP9 表达量的降低会导致A. thaliana双受精过程中卵细胞受精受到显著抑制6。
由于双受精发生在胚囊中，而胚囊嵌于胚珠内，且进一步被子房组织包裹，因此很难直接观察和分析双受精过程的各个状态。正因如此，目前仍存在许多尚未明确的....
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方案
1. 人工授粉
注意：开始操作前，需要准备一把5号镊子。
- 培养 A. thaliana 在生长培养箱中，22 °C 条件下，16 小时光照/8 小时黑暗循环培养（Col-0）。
注意： 用剪刀剪除最先发育的花茎，以促进腋芽的发育。生长旺盛的植株（剪除第一花茎后2-3周，株高约25 cm）适合用于分析。 - 去雄时，去除萼片（图1B），花瓣（图1C）和雄蕊（图1D11阶段花蕾的）8 (图1A使用5号镊子操作，以顶部带有少量花瓣的花蕾为最佳。
注意： 使用合适的雌配子标记品系。在本方案中，我们以野生型植株作为母本。 - 去雄后15至18小时，取一朵花的雄蕊 DMP9KD/HTR10-mRFP 13期花8 用镊子夹住灯丝。
- 授粉时，用开裂的花药轻轻拍打去....
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结果
在授粉后7-8小时采集了用DMP9KD/HTR10-mRFP授粉的雌蕊中的胚珠并进行观察。
大多数胚珠在卵细胞（珠孔端）和中央细胞（合点端）的细胞核位置分别含有两个去凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3A），表明双受精成功。此外，还观察到一些胚珠中中央细胞核位置含有一个去凝集的mRFP标记的精子细胞核，而在卵细胞外存在一个凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3B），表明发生了单受精。在双受精失败的情况下，在卵细胞与中央细胞交界处可观察到两个凝集的mRFP标记的精子细胞核（图3C），这与gcs1突变体精子细胞的表型一致（图3D）.......
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讨论
HTR10-mRFP 标记父本染色质（即可视化精子细胞核），其在双受精过程中的动态已有报道7。花粉管释放后，HTR10-mRFP 标记的精子核仍处于凝缩状态。然而，在配子膜融合后三至四小时的核融合阶段，每个精子核在与已受精的雌配子核合并时发生去凝缩7。未受精的精子细胞则保持凝缩状态，如在 gcs1 精子细胞因未能受精而在胚囊中停滞所示（图3D）。通常情况下，当可育的 HTR10-mRFP 作为花粉亲本时，在授粉后7-8小时（HAP），一个雌蕊中57.9% ± 17.8%（均值 ± 标准差；n = 16 个雌蕊）的胚珠含有两个 mRFP 标记的精子核信号，且几乎所有信号（97.2%）均呈去凝缩状态，反映出成功的双受精（类似信号模式见于 图3A）。在 DMP9KD/HTR10-mRFP 情况下，含有两个 mRFP 标记精子核的胚珠出.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了日本学术振兴会科学研究费助成项目（JSPS KAKENHI 拨款 JP17H05832 至 T. I.）以及千叶大学（日本）植物化学物质植物分子科学战略性优先研究推进计划经费的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BX51 | Olympus | 落射荧光显微镜 | |
| 盖玻片 | Matsunami 玻璃 | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | 拟南芥, HTR10-mRFP 背景 Takahashi 等（2018）6 | ||
| 双面胶带 | Nichiban | NW-15S | 15 mm 宽度 |
| DP72 | Olympus | 数码相机 | |
| 镊子 | 活力 | 任何5号镊子均可使用 | |
| 生长室 | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | 拟南芥生态型哥伦比亚-0（Col-0）背景 Ingouff 等（2007）7 | ||
| 注射针 | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| 载玻片 | Matsunami 玻璃 | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | 解剖显微镜 | |
| U-MRFPHQ | Olympus | 荧光滤光立方体（激发：BP535-555，发射：BA570-625，二向色镜：DM565） | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | 物镜（数值孔径 1.3），油浸 | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | 物镜（NA 0.75），干镜 |
参考文献
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuro....
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重印与许可
