Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise
Summary
Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d’Arabidopsis utilisant un microscope d’épifluorescence.
Abstract
Les plantes à fleurs ont un système unique de reproduction sexuelle appelé « double fécondation », dans lequel chacun des spermatozoïdes fusionne précisément avec un ovule ou une cellule centrale. Ainsi, deux événements de fécondation indépendants ont lieu presque simultanément. L’ovule fécondé et la cellule centrale se développent en zygote et endosperme, respectivement. Par conséquent, un contrôle précis de la double fécondation est essentiel pour le développement des semences qui s’ensuit. La double fécondation se produit dans le gamétophyte femelle (sac d’embryon), qui est profondément caché et couvert de tissus épais d’ovule et d’ovaire. Cette construction de tissu de pistil rend l’observation et l’analyse de la double fertilisation tout à fait difficile et a créé la situation actuelle dans laquelle beaucoup de questions concernant le mécanisme de double fertilisation restent sans réponse. Pour l’évaluation fonctionnelle d’un candidat potentiel pour l’organisme de réglementation de la fécondation, l’analyse phénotypique de la fécondation est importante. Pour juger de l’achèvement de la fécondation dans Arabidopsis thaliana, les formes des signaux de fluorescence étiquetant les noyaux de sperme sont utilisés comme indicateurs. Un spermatozoïde qui ne parvient pas à féconder est indiqué par un signal de fluorescence condensé à l’extérieur des gamètes femelles, tandis qu’un spermatozoïde qui féconde avec succès est indiqué par un signal décondensé dû à la karyogamy avec le noyau des gamètes femelles. La méthode décrite ici fournit un outil pour déterminer la fécondation réussie ou échouée dans des conditions in vivo.
Introduction
Les plantes à fleurs produisent des graines par double fécondation, un processus qui est directement contrôlé par les interactions entre les protéines localisées sur la membrane plasmatique gamète1,2. Les gamètes mâles de plante de floraison, une paire de spermatozoïdes, se développent dans le pollen. Un tube de pollen qui se développe après la pollinisation fournit une paire de spermatozoïdes aux gamètes femelles, un ovule et une cellule centrale, qui se développent dans un sac d’embryon. Après la rencontre des gamètes mâles et femelles, les protéines sur la surface du gamète favorisent la reconnaissance, l’attachement et la fusion pour compléter la double fécondation. Dans des études antérieures, les protéines mâles de membrane de gamètegenerative CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 et GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 ont été identifiées comme régulateurs de fertilisation impliqués dans la fusion de gamètes et attachement, respectivement. Nous avons récemment identifié une protéine membranaire spécifique au gamète mâle, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), en tant que régulateur de fertilisation impliqué dans l’interaction gamète. Nous avons constaté qu’une diminution de l’expression de DMP9 a comme conséquence l’inhibition significative de la fertilisation de cellules d’oeuf pendant la double fertilisation dans A. thaliana6.
Comme la double fécondation se produit dans un sac d’embryon, qui est incorporé dans un ovule qui est encore enveloppé avec le tissu d’ovaire, il est difficile d’observer et d’analyser les états des processus de double fécondation. Pour cette raison, il y a encore beaucoup de points peu clairs qui entravent une compréhension complète du mécanisme entier de contrôle de double fertilisation. La mise en place de techniques d’observation pour retracer le comportement des gamètes lors de la double fécondation dans des conditions in vivo est indispensable à l’analyse fonctionnelle des candidats potentiels pour les régulateurs de fécondation. Des études récentes ont donné des lignes de marqueur où les structures sous-cellulaires gamètes sont étiquetées avec des protéines fluorescentes. Dans cet article, nous démontrons un protocole simple et rapide pour observer la double fertilisation qui s’est produite dans un sac d’embryon dérivé des pistils artificiellement pollinisés. L’utilisation de la ligne de marqueurde noyau de cellules de sperme HTR10-mRFP 7, l’état de fertilisation de chaque gamète femelle peut être discriminé sur la base de la morphologie nucléaire de signal de sperme. Notre protocole se concentrant sur un tel changement morphologique des noyaux de sperme à la fertilisation peut obtenir efficacement une quantité suffisante de données pour la preuve statistique. Une ligne DMP9-knockdownavec hTR10-mRFP fond (DMP9KD/HTR10-mRFP) a été utilisé comme plantes mâles pour montrer un modèle de fertilisation unique. Le protocole convient également à l’analyse fonctionnelle d’autres organismes de réglementation de la fertilisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP étiquette la chromatine paternelle (c.-à-d., visualise les noyaux de spermatozoïdes), et la dynamique dans la double fécondation ont été rapportés7. Immédiatement après la libération d’un tube de pollen, les noyaux de sperme HTR10-mFP-étiquetés sont toujours condensés. Cependant, chacun des noyaux de sperme est décondensé en fusionnant avec un noyau de gamète femelle fertilisé à la karyogamy trois à quatre heures après fusion de membrane de gamète7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention kaKENHI de la Japan Society for the Promotion of Science (JP17H05832 à T. I.) et par le financement du Programme de promotion de la recherche prioritaire stratégique sur les sciences moléculaires des plantes phytochimiques de l’Université chiba (Japon).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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