הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה
Summary
אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.
Abstract
צמחים פורחים יש מערכת ייחודית רבייה מינית בשם ‘ הפריה כפולה ‘, שבה כל אחד מתאי הזרע מנתיכים בדיוק עם תא ביצה או תא מרכזי. לפיכך, שני אירועי הפריה עצמאיים מתרחשים כמעט בו זמנית. תא הביצית המופרית והתא המרכזי מתפתחים לזיגוטה ולאנדוזרע, בהתאמה. לכן, שליטה מדויקת של הפריה כפולה חיונית להתפתחות הזרעים שלאחר מכן. הפריה כפולה מתרחשת בתוך הנקבה המאובמת (שק העובר), אשר מוסתרים עמוקות מכוסה ברקמה עבה ורקמות שחלות. הבנייה הזאת רקמת העור עושה התבוננות וניתוח של הפריה כפולה די קשה ויצר את המצב הנוכחי שבו שאלות רבות לגבי המנגנון של הפריה כפולה נותרו ללא מענה. עבור הערכה תפקודית של מועמד פוטנציאלי לווסת הדישון, ניתוח פנוטימית של הפריה חשוב. כדי לשפוט את השלמת ההפריה ב Arabidopsis thaliana, הצורות של אותות פלואורסצנטית תיוג גרעינים זרע משמשים אינדיקטורים. תא זרע שאינו מגיע להפרות מצוין על-ידי אות מעובה מחוץ למשחק הנשי, ואילו תא זרע שמפרה בהצלחה מצוין על-ידי אות שאינו מעובד כתוצאה מקריסוגמיה בגרעין המגיים הנשי. השיטה המתוארת כאן מספקת כלי לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה תחת בתנאים vivo.
Introduction
צמחים פורחים לייצר זרעים באמצעות הפריה כפולה, תהליך זה נשלט ישירות על ידי אינטראקציות בין חלבונים מקומי על ממברנה פלזמה תא רבייה1,2. פורח מפעל גברי, זוג תאים זרע, לפתח אבקה. שפופרת אבקה הצומחת לאחר האבקה מספקת זוג תאי זרע למשחק נקבה, תא ביצה ותא מרכזי, המתפתחים לתוך שק העובר. לאחר המשחק הגברי והנשי נפגשים, חלבונים על פני משטח גמטות לקדם הכרה, החזקה, והיתוך להשלים הפריה כפולה. במחקרים קודמים, קרום המשחק הגברי חלבונים תא מסוים 1 (GCS1)/הסיס 2 (HAP2)3,4 ו-תא רבייה ביטא 2 (GEX2)5 זוהו כרגולטורים הפריה מעורבים היתוך תא רבייה ו מצורף, בהתאמה. לאחרונה זיהינו מDUF679 זכר הממברנה הספציפי חלבון, תחום ממברנה חלבון 9 (DMP9), כמו וסת הפריה מעורב אינטראקציה תא רבייה. מצאנו כי ירידה של DMP9 ביטוי התוצאות עיכוב משמעותי של הפריה תא ביצה במהלך הפריה כפולה ב . thaliana6.
כמו הפריה כפולה מתרחשת שק העובר, אשר מוטבע בתוך ביצית כי הוא עטוף עוד עם רקמת שחלות, קשה להתבונן ולנתח את מצבי תהליכים הפריה כפולה. מסיבה זו, עדיין יש הרבה נקודות ברורות שיגבילו הבנה מלאה של המנגנון כולו של בקרת הפריה כפולה. הקמת טכניקות התבוננות כדי לעקוב אחר התנהגותו של גמטות במהלך הפריה כפולה תחת בתנאים vivo היא הכרחית לניתוח פונקציונלי של מועמדים פוטנציאליים הפריה ווסת. מחקרים שנעשו לאחרונה הניבו קווי סמן שבו מבנים subcellular המשחק מסומנים עם חלבונים פלורסנט. במאמר זה, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט ומהיר להתבוננות הפריה כפולה שהתרחשה שק העובר נגזר מpistils מלאכותית מלאכותי. באמצעות תא זרע הגרעין סמן קו HTR10-mRFP7, מצב הדישון של כל מגיים נקבה יכול להיות מופלים על בסיס של זרע המבנה הגרעיני האותות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בשינוי מורפולוגי כזה של גרעיני הזרע בהפריה יכול להשיג ביעילות כמות מספקת של נתונים עבור הוכחה סטטיסטית. קו DMP9-מיקוד עם רקע HTR10-mrfp (DMP9KD/HTR10-mrfp) שימש צמחים זכרים כדי להראות דפוס הפריה יחיד. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח פונקציונלי של מוסבי הפריה אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP תוויות כרומטין אבהי (כלומר, לדמיין גרעיני תא זרע), ואת הדינמיקה הפריה כפולה דווחו7. מיד לאחר שחרורו מצינור אבקה, גרעיני זרע HTR10-mRFP עדיין צפוף. עם זאת, כל גרעין הזרע הוא לפרק עם מיזוג עם הגרעין הנקבי מגיים הנקבה בקאריומיה שלוש עד ארבע שעות לאחר פיוז ‘ ן קרום ממברנה7</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI מענק (JP17H05832 T. I.) ועל ידי מימון של תוכנית קידום המחקר בעדיפות אסטרטגית על פיטוכימיקלים הצמח מדעי מולקולרית, אוניברסיטת צ’יבה (יפן).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
