Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis
Summary
Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.
Abstract
Las plantas con flores tienen un sistema de reproducción sexual único llamado “doble fertilización”, en el que cada una de las células espermáticas se fusiona con precisión con una célula de óvulo o una célula central. Por lo tanto, dos eventos de fertilización independientes tienen lugar casi simultáneamente. La célula fértil del óvulo y la célula central se desarrollan en cigota y endospermo, respectivamente. Por lo tanto, el control preciso de la doble fertilización es esencial para el desarrollo de semillas subsiguientes. La doble fertilización ocurre en el gametofito femenino (sac embrionario), que está profundamente oculto y cubierto con tejidos gruesos de ovulo y ovario. Esta construcción de tejido pistilo hace que la observación y el análisis de la doble fertilización sean bastante difíciles y ha creado la situación actual en la que muchas preguntas sobre el mecanismo de doble fertilización permanecen sin respuesta. Para la evaluación funcional de un candidato potencial para el regulador de la fertilización, el análisis fenotípico de la fertilización es importante. Para juzgar la realización de la fertilización en Arabidopsis thaliana, las formas de señales de fluorescencia que etiquetan núcleos espermáticos se utilizan como indicadores. Una célula espermática que no fertiliza se indica mediante una señal de fluorescencia condensada fuera de los gametos femeninos, mientras que una célula espermática que fertiliza con éxito está indicada por una señal decondensada debido a la karyogamía con el núcleo de los gametos femeninos. El método descrito aquí proporciona una herramienta para determinar la fertilización exitosa o fallida en condiciones in vivo.
Introduction
Las plantas con flores producen semillas a través de la doble fertilización, un proceso que se controla directamente mediante interacciones entre proteínas localizadas en la membrana plasmática gameto1,2. La floración de los gametos masculinos de las plantas, un par de espermatozoides, se desarrollan en el polen. Un tubo de polen que crece después de la polinización entrega un par de espermatozoides a gametos femeninos, una célula de óvulo y una célula central, que se desarrollan en un saco embrionario. Después de que los gametos masculinos y femeninos se encuentran, las proteínas en la superficie del gameto promueven el reconocimiento, el apego y la fusión para completar la doble fertilización. En estudios anteriores, las proteínas de membrana de gameto masculino GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 y GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 se identificaron como reguladores de fertilización involucrados en la fusión de gametos y adjunto, respectivamente. Recientemente identificamos una proteína de membrana específica del gameto masculino, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), como un regulador de fertilización involucrado en la interacción de gametos. Encontramos que una disminución de la expresión DMP9 resulta en una inhibición significativa de la fertilización de células de óvulo sin efecto durante la fertilización doble en A. thaliana6.
Como la fertilización doble se produce en un saco embrionario, que está incrustado en un óvulo que se envuelve aún más con tejido ovárizado, es difícil observar y analizar los estados de los procesos de fertilización doble. Por esta razón, todavía hay muchos puntos poco claros que dificultan una comprensión completa de todo el mecanismo de control de doble fertilización. El establecimiento de técnicas de observación para rastrear el comportamiento de los gametos durante la doble fertilización en condiciones in vivo es indispensable para el análisis funcional de los posibles candidatos para los reguladores de fertilización. Estudios recientes han dado lugar a líneas de marcadores donde las estructuras subcelulares gameto están etiquetadas con proteínas fluorescentes. En este artículo, demostramos un protocolo simple y rápido para observar la doble fertilización que se ha producido en un saco embrionario derivado de pistilos polinizados artificialmente. Utilizando la línea de marcador de núcleo de células espermáticas HTR10-mRFP7, el estado de fertilización de cada gameto femenino puede ser discriminado sobre la base de la morfología de la señal nuclear de espermatozoides. Nuestro protocolo centrado en tal cambio morfológico de los núcleos espermáticos en la fertilización puede obtener eficientemente una cantidad suficiente de datos para la prueba estadística. Se utilizó una línea de derribo DMP9con fondo HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) como plantas masculinas para mostrar un único patrón de fertilización. El protocolo también es adecuado para el análisis funcional de otros reguladores de fertilización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etiquetas HTR10-mRFP cromatina paterna (es decir, visualiza núcleos de células espermáticas), y la dinámica en la fertilización doble se han reportado7. Inmediatamente después de la liberación de un tubo de polen, los núcleos de espermatozoides con etiqueta HTR10-mRFP todavía se condensan. Sin embargo, cada uno de los núcleos espermáticos se descondensa al fusionarse con un núcleo de gameto femenino fertilizado en karyogamy de tres a cuatro horas después de la fusión de la membrana d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la beca KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JP17H05832 a T. I.) y por la financiación del Programa Estratégico de Promoción de la Investigación Prioritaria sobre Ciencias Moleculares Plantas Fitoquímicas, Universidad de Chiba (Japón).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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