Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis
Summary
Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.
Abstract
As plantas de florescência têm um sistema sexual original da reprodução chamado ‘ fertilização dobro ‘, em que cada um das pilhas do sperm funde precisamente com uma pilha de ovo ou uma pilha central. Assim, dois eventos de fertilização independente acontecem quase que simultaneamente. A pilha de ovo fertilizada e a pilha central tornam-se no zigoto e no endosperm, respectivamente. Portanto, o controle preciso da dupla adubação é essencial para o desenvolvimento de sementes que se seguiu. A fertilização dupla ocorre no gametófito fêmea (saco do embrião), que é profundamente escondida e coberta com os tecidos grossos do óvulo e do ovário. Esta construção do tecido do pistilo faz a observação e a análise da fertilização dobro completamente difícil e criou a situação atual em que muitas perguntas a respeito do mecanismo da fertilização dobro permanecem sem resposta. Para a avaliação funcional de um candidato potencial para o regulador da fertilização, a análise fenotípica da fertilização é importante. Para julgar a conclusão da fertilização em Arabidopsis Arabidopsis thaliana, as formas de sinais de fluorescência rotulando núcleos de espermatozóides são usadas como indicadores. Uma célula espermática que não fertilizar é indicada por um sinal de fluorescência condensado fora das gametas femininas, enquanto uma célula espermática que fertiliza com sucesso é indicada por um sinal desnaturado devido à carigamia com o núcleo feminino dos gametas. O método descrito aqui fornece uma ferramenta para determinar a fertilização bem-sucedida ou fracassada em condições in vivo.
Introduction
Plantas floridas produzem sementes através de dupla adubação, um processo que é controlado diretamente por interações entre proteínas localizadas na membrana plasmáticadegameta 1,2. Os gametas masculinos da planta de florescência, um par de pilhas de esperma, desenvolvem-se no pólen. Um tubo de pólen que cresce após a polinização entrega um par de células espermáticas para gametas femininas, uma célula de ovo e uma célula central, que se desenvolvem em um saco embrionário. Depois que os gametas masculinos e femininos se encontram, as proteínas na superfície do gameta promovem o reconhecimento, o acessório, e a fusão para terminar a fertilização dobro. Em estudos prévios, as proteínas da membrana do gameta masculino Generative Cell SPECIFIC 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4e gameta expressadas 2 (GEX2)5 foram identificadas como reguladores de fertilização envolvidos na fusão de gametas e acessório, respectivamente. Nós identificamos recentemente uma proteína gameta-específica masculina da membrana, proteína 9 da membrana do domínio DUF679 (DMP9), como um regulador da fertilização envolvido na interação do gameta. Verificou-se que uma diminuição da expressão de DMP9 resulta em inibição significativa da adubação de células de ovo durante a dupla adubação em a. Arabidopsis thaliana6.
Como a fertilização dupla ocorre em um saco embrionário, que é incorporado em um óvulo que é mais envolvido com o tecido do ovário, é difícil observar e analisar os Estados de processos de fertilização dupla. Por esta razão, ainda há muitos pontos obscuros que impedem uma compreensão completa de todo o mecanismo de controle de fertilização dupla. O estabelecimento de técnicas de observação para traçar o comportamento dos gâmetas durante a dupla adubação condições in vivo é indispensável para a análise funcional de potenciais candidatos a reguladores de fertilização. Estudos recentes produziram linhas de marcador onde as estruturas subcelulares do gameta são rotuladas com proteínas fluorescentes. Neste artigo, demonstramos um protocolo simples e rápido para observar a dupla adubação que ocorreu em um saco embrionário derivado de pistilos artificialmente polinados. Usando a linha do marcador do núcleo da célula espermática HTR10-MRFP7, o estado da fertilização de cada gameta fêmea pode ser discriminado com base na morfologia nuclear do sinal do esperma. Nosso protocolo focalizando em tal mudança morfológica dos núcleos do esperma na fertilização pode eficientemente obter uma quantidade suficiente de dados para a prova estatística. Uma linha DMP9-knockdown com fundo HTR10-MRFP (DMP9KD/HTR10-MRFP) foi usada como plantas masculinas para mostrar um único teste padrão da fecundação. O protocolo também é adequado para a análise funcional de outros reguladores de fertilização.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP rotula a cromatina paterna (isto é, visualiza núcleos de células espermáticas), e a dinâmica na fertilização dupla foi relatada7. Imediatamente após a liberação de um tubo de pólen, HTR10-mRFP-rotulado núcleos de esperma ainda são condensados. Entretanto, cada um dos núcleos do esperma é desdensed em cima da fusão com um núcleo fêmea fertilizado do gameta em karyogamy três a quatro horas após a fusão7da membrana do gameta. As células de espe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) e pelo financiamento do programa de promoção estratégica de pesquisa prioritária em fitoquímica Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japão).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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