アラビドプシス二重受精における精子核形態をたどる受精状態の評価
Summary
アラビドプシス二重受精における精子核形態に基づいて成功または失敗した受精を決定する方法をエピ蛍光顕微鏡で示す。
Abstract
開花植物は、「二重受精」と呼ばれるユニークな性的再生システムを持っており、それぞれの精子細胞が卵細胞または中央細胞と正確に融合します。したがって、2つの独立した受精イベントがほぼ同時に起こる。受精卵細胞と中枢細胞はそれぞれザイゴットとエンドスパームに発達する。したがって、二重受精の正確な制御は、その後の種子開発のために不可欠です。二重受精は、深く隠され、厚い卵巣および卵巣組織で覆われている女性のゲームトフィート(胚嚢)で起こる。この雌しべ組織構造は、二重受精の観察と分析を非常に困難にし、二重受精のメカニズムに関する多くの疑問が未解決のままである現状を作成しました。受精レギュレータ候補の機能評価には、受精の見型分析が重要である。アラビドプシス・タリアナにおける受精の完了を判断するために、精子核を標識する蛍光シグナルの形状が指標として用いられる。受精に失敗した精子細胞は、メスのゲーテの外側に凝縮された蛍光信号によって示されるのに対し、正常に受精する精子細胞は、女性のゲーテの核を持つカルヨガミーによる凝縮信号によって示される。ここで説明する方法は、生体内条件下での受精の成功または失敗を決定するツールを提供する。
Introduction
開花植物は、二重受精を介して種子を生成し、ゲーム血漿膜1、2に局在するタンパク質間の相互作用によって直接制御されるプロセスである。開花植物オスのガメ、精子細胞のペアは、花粉で発症します。受粉後に成長する花粉管は、雌のゲーム、卵細胞、胚嚢で発達する中央細胞に精子細胞のペアを提供します。オスとメスのゲームが出会った後、ゲームの表面のタンパク質は、認識、付着、融合を促進し、二重受精を完了します。これまでの研究では、オスのガメテ膜タンパク質生成細胞特異的1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)3、4、およびGAMETE発現2(GEX2)5は、ガメ融合に関与する受精調節剤として同定され、 添付ファイルは、それぞれ。我々は最近、男性のガメテ特異的膜タンパク質、DUF679ドメイン膜タンパク質9(DMP9)を、ゲームと相互作用に関与する受精調節器として同定した。我々は、DMP9発現の減少は、A.タリアナ6における二重受精中の卵細胞受精の有意な阻害をもたらすことを見出した。
卵巣組織でさらに包まれた卵巣に埋め込まれた胚嚢に二重受精が起こるので、二重受精プロセスの状態を観察し、分析することは困難である。このため、二重受精制御のメカニズム全体を完全に理解するのを妨げる多くの不明確な点が依然として存在する。生体内条件下での二重受精中のガメテの挙動を追跡する観察技術の確立は、受精レギュレータの候補候補の機能解析に不可欠である。最近の研究では、ガメの細胞内構造が蛍光タンパク質で標識されるマーカーラインが得られた。この記事では、人工的に受粉した雌しべに由来する胚嚢で発生した二重受精を観察するための簡単で迅速なプロトコルを示す。精子細胞核マーカーラインHTR10-mRFP7を用いて、各メスの受精状態は精子核信号形態に基づいて判別することができる。受精時の精子核の形態的変化に焦点を当てた我々のプロトコルは、統計的証拠のために十分な量のデータを効率的に得ることができる。HTR10-mRFPの背景(DMP9 KD/HTR10-mRFP)を持つDMP9-ノックダウンラインを男性植物として使用し、単一の受精パターンを示した。このプロトコルは、他の受精レギュレータの機能解析にも適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFPは、父方クロマチン(すなわち、精子細胞核を可視化する)を標識し、二重受精におけるダイナミクスが7に報告されている。花粉管からの放出直後に、HTR10-mRFP標識精子核は依然として凝縮されている。しかし、各精子核は、カルヨガミーで受精したメスのガメ核と合併すると凝縮され、3~4時間後にゲーム膜融合7が行われている。未受精精子細胞は…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、日本学術振興会(JP17H05832 to T.I.)の支援を受け、千葉大学植物化学植物分子科学戦略優先研究推進プログラムの助成を受けました。
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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