Summary

Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Published: August 29, 2019
doi:

Summary

Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Abstract

Blühende Pflanzen haben ein einzigartiges sexuelles Reproduktionssystem namens “Doppelte Befruchtung”, in dem jede der Spermien präzise mit einer Eizelle oder einer zentralen Zelle verschmilzt. So finden fast gleichzeitig zwei unabhängige Düngeereignisse statt. Die befruchtete Eizelle und die Zentralzelle entwickeln sich zu Zygoten bzw. Endospermen. Daher ist eine präzise Kontrolle der Doppeldüngung für die anschließende Saatgutentwicklung unerlässlich. Die doppelte Befruchtung erfolgt im weiblichen Gametophyten (Embryosack), der tief versteckt und mit dicken Eizellen und Eierstockgeweben bedeckt ist. Diese Stempelgewebekonstruktion erschwert die Beobachtung und Analyse der Doppeldüngung und hat die gegenwärtige Situation geschaffen, in der viele Fragen zum Mechanismus der Doppeldüngung unbeantwortet bleiben. Für die funktionelle Bewertung eines potenziellen Kandidaten für die Düngungsregulierer ist eine phänotypische Analyse der Befruchtung wichtig. Um den Abschluss der Befruchtung in Arabidopsis thalianazu beurteilen, werden die Formen von Fluoreszenzsignalen, die Spermienkerne kennzeichnen, als Indikatoren verwendet. Eine Spermienzelle, die nicht befruchtet, wird durch ein kondensiertes Fluoreszenzsignal außerhalb der weiblichen Gameten angezeigt, während eine Spermienzelle, die erfolgreich befruchtet, durch ein dekondensiertes Signal aufgrund von Karyogamie mit dem Weiblichen Gametenkern angezeigt wird. Die hier beschriebene Methode stellt ein Werkzeug zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung unter in vivo-Bedingungen dar.

Introduction

Blühende Pflanzen produzieren Samen durch doppelte Befruchtung, ein Prozess, der direkt durch Wechselwirkungen zwischen Proteinen gesteuert wird, die auf Gamete Plasmamembran1,2lokalisiert sind. Blühende Pflanzenmännchen gameten, ein Paar Spermien, entwickeln sich in Pollen. Ein Pollenrohr, das nach der Bestäubung wächst, liefert ein Paar Spermien an weibliche Gameten, eine Eizelle und eine zentrale Zelle, die sich in einem Embryosack entwickeln. Nachdem sich die männlichen und weiblichen Gameten treffen, fördern Proteine auf der Gamete-Oberfläche Die Erkennung, Anhaftung und Fusion, um eine doppelte Befruchtung zu vollenden. In früheren Studien wurden die männlichen Gamete-Membranproteine GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 und GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 als Befruchtungsregulatoren identifiziert, die an der Gamete-Fusion und Anlage. Kürzlich haben wir ein männliches Gamete-spezifisches Membranprotein, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), als Düngeregulator identifiziert, der an der Gamete-Interaktion beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass eine Abnahme der DMP9-Expression zu einer signifikanten Hemmung der Befruchtung von Eizellen während der Doppelbefruchtung in A. thaliana6führt.

Da die Doppelbefruchtung in einem Embryosack auftritt, der in eine Eizelle eingebettet ist, die weiter mit Eierstockgewebe umwickelt ist, ist es schwierig, die Zustände von Doppelbefruchtungsprozessen zu beobachten und zu analysieren. Aus diesem Grund gibt es noch viele unklare Punkte, die ein vollständiges Verständnis des gesamten Mechanismus der doppelten Düngungskontrolle behindern. Die Etablierung von Beobachtungstechniken zur Verfolgung des Verhaltens von Gameten während der Doppelten Befruchtung unter in vivo-Bedingungen ist für die funktionelle Analyse potenzieller Kandidaten für Diebesregulatoren unerlässlich. Jüngste Studien haben Markerlinien ergeben, in denen subzelluläre Strukturen von Gamete mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind. In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und schnelles Protokoll zur Beobachtung der doppelten Befruchtung, das in einem Embryosack aufgetreten ist, der aus künstlich bestäubten Stempeln stammt. Mit Spermienkern MarkerLinie HTR10-mRFP7, kann der Befruchtungszustand jeder weiblichen Gamete auf der Grundlage der Spermien Kernsignal Morphologie diskriminiert werden. Unser Protokoll, das sich auf eine solche morphologische Veränderung der Spermienkerne bei der Befruchtung konzentriert, kann effizient eine ausreichende Menge an Daten für den statistischen Nachweis erhalten. Eine DMP9-Knockdown-Linie mit HTR10-mRFP-Hintergrund (DMP9KD/HTR10-mRFP) wurde als männliche Pflanzen verwendet, um ein einzelnes Düngemuster zu zeigen. Das Protokoll eignet sich auch für die funktionelle Analyse anderer Düngeregler.

Protocol

1. Künstliche Bestäubung HINWEIS: Vor Beginn des Prozesses ist ein Paar Nr. 5 Zangen erforderlich. A. thaliana (Col-0) bei 22 °C unter einem 16-h-Licht-/8-h-Dunkelzyklus in einer Wachstumskammer anbauen.HINWEIS: Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Kräftig wachsende Pflanzen (2-3 Wochen nach dem Schneiden des ersten Stiels; Pflanzenhöhe ca….

Representative Results

Ovules aus einem mit DMP9KD/HTR10-mRFP bestäubten Stempel wurden bei 7-8 HAP gesammelt und beobachtet. Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle (Mikropylarseite) und zentralen Zellkernpositionen (Abbildung3A),was auf eine erfolgreiche Doppelbefruchtung hindeutet. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensier…

Discussion

HTR10-mRFP-Etiketten väterliches Chromatin (d. h. visualisiert Spermienkerne), und die Dynamik bei der Doppelbefruchtung wurde berichtet7. Unmittelbar nach der Freisetzung aus einem Pollenrohr werden HTR10-mRFP-markierte Spermakerne noch kondensiert. Jedoch, jeder der Spermienkerne wird bei der Verschmelzung mit einem befruchteten weiblichen Gamete-Kern bei Karyogamy drei bis vier Stunden nach Gamete Membranfusion7dekondensiert. Unbefruchtete Spermien bleiben kondensiert, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) und durch die Förderung des Strategic Priority Research Promotion Program on Phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan) unterstützt.

Materials

BX51 Olympus Epifluorescence microscope
Cover glass Matsunami glass C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape Nichiban NW-15S 15 mm width
DP72 Olympus Degital camera
Forceps Vigor Any No. 5 forceps are available
Growth chamber Nihonika LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. (2007)7
Injection needle Terumo NN-2719S 27 gauge
Slide glass Matsunami glass S9443
SZX9 Olympus Dissecting microscope
U-MRFPHQ Olympus Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x Olympus Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x Olympus Objective lens (NA0.75), dry

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Cite This Article
Takahashi, T., Igawa, T. Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization. J. Vis. Exp. (150), e59916, doi:10.3791/59916 (2019).

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