在胶原蛋白诱发关节炎模型中，用于处理小鼠爪的冷冻粉碎协议，用于评估组织炎症的分子通路
Summary
开发了一种使用液氮冷冻机加工鼠爪的低温粉碎方法，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的产量和质量，并分析与炎症相关的分子图谱反应。
Abstract
分析局部组织的分子变化对于理解体内治疗候选者的作用机制至关重要。在关节炎研究领域，许多研究都集中在由骨、软骨、肌肉、基质细胞和免疫细胞的复杂混合物组成的发炎关节上。在这里，我们建立了一种可靠而可靠的机械方法，在低温控制的环境中将发炎的小鼠爪子干扰成均匀的粉碎样品。蛋白质和RNA解热物被加工，使蛋白质组和转录端点和分子表征相关疾病途径在局部组织。
Introduction
类风湿性关节炎（RA）是一种慢性全身性炎症性疾病，关节持续对称性脊柱炎，皮肤、心脏、肺和眼睛等器官的关节外介入1。虽然免疫反应的系统性表现在人类患者中是明显的，但RA病理学的标志之一是免疫细胞在阴膜组织中渗透和阴纤维细胞2的增殖。
与人类RA类似，小鼠胶原蛋白诱发关节炎（CIA）模型引起强烈的组织炎症，在阴膜组织和系统隔间中产生活跃的免疫反应。不同小鼠菌株对CIA模型的易感性与主要组织相容性复合物（MHC）单倍型和抗原特异性T细胞和B细胞相互作用3、4。此外，人类RA中的许多致病途径，包括自身抗体产生、免疫复合沉积、骨髓细胞活化、多关节表现和带子免疫渗透的泛鼻形成，也在这个模型中明显5，6.调查人员已经利用这个成熟的中情局模型来调查抗炎细胞因子治疗的效果。在中情局模型8、9中，许多被批准用于自身免疫或炎症性疾病的生物制剂，如抗TNF®和抗IL-6，都有效。
分析免疫系统在系统组织中的相互作用对于阐明与RA的发病机制相关的分子机制至关重要。在人类临床环境中，一种常见的做法是在超声成像的指导下进行针刺活检。在临床前环境中，鼠关节的较小结构使得活检程序更加困难，如果不是不可能的话。最近，我们演示了利用鼠中情局模型来评估药物组合，以影响不同的终点和解决疾病的组合方法10。采用低温冷冻机粉碎法，将发炎的鼠爪加工成均匀的细粉，并建立了下游工艺，以提取RNA和蛋白质。该方法保护RNA和蛋白质免受酶和化学降解过程的刺激，并使我们能够将多种分析方法应用于单一均质样品源。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然评估阴骨组织分子通路有强有力的科学依据，但许多关于鼠CIA模型免疫分析的报告都集中在外周血上，而发炎的爪子的蛋白质和RNA分析数据则相当有限。造成这种偏差的原因有几个：鼠脚踝关节不超过±2厘米;受影响的区域包括皮肤、骨骼和结缔组织，这些组织通常难以使用传统方法，如组织磨床、刺和砂浆、硅珠破坏、三聚体或酶消化等，难以同质化。这些方法通常会导致不完全均质化、蛋…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢伊迪丝·詹森对手稿的批判性评论，纳文·拉奥和詹妮弗·汤恩支持出版这份手稿。
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
