Un protocole de cryo-pulvérisation pour le traitement des pattes de souris pour évaluer les voies moléculaires de l'inflammation des tissus dans un modèle d'arthrite induite par le collagène

Summary

Une méthode cryogénique de pulvérisation pour traiter les pattes murines à l’aide d’une usine de congélation à azote liquide a été mise au point pour améliorer le rendement et la qualité de l’ARN ou des protéines extraits des tissus et permettre l’analyse des profils moléculaires associés aux Réponses.

Abstract

Le profilage des changements moléculaires dans les tissus locaux est crucial pour comprendre le mécanisme d’action des candidats thérapeutiques in vivo. Dans le domaine de la recherche sur l’arthrite, de nombreuses études sont axées sur les articulations enflammées qui sont composées d’un mélange complexe d’os, de cartilage, de muscle, de cellules stromales et de cellules immunitaires. Ici, nous avons établi une méthode mécanique fiable et robuste pour perturber les pattes de souris enflammées en échantillons pulvérisés homogènes dans un environnement cryogéniquement contrôlé. Des lysates de protéine et d’ARN ont été traités pour permettre des paramètres protéomiques et transcriptionnels et la caractérisation moléculaire des voies pertinentes de la maladie dans les tissus locaux.

Introduction

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire systémique chronique avec une synovite symétrique persistante dans les articulations et une implication articulaire supplémentaire d’organes tels que la peau, le cœur, les poumons et les yeux¹. Bien que les manifestations systémiques de la réponse immunitaire soient évidentes dans les patients humains, une des caractéristiques de la pathologie de RA est l’infiltration des cellules immunitaires dans le tissu synovial et la prolifération des cellules synovials de fibroblaste^2.

Semblable à la RA humaine, le modèle induit par l’arthrite de collagène de souris (CIA) suscite l’inflammation forte de tissu avec des réponses immunitaires actives dans les tissus synovials et les compartiments systémiques. La susceptibilité des différentes souches de souris aux liens de modèle de CIA au complexe d’histocompatibilité majeure (MHC) haplotype et antigène spécifiques interactions de cellules T et b de cellules^3,4. En outre, beaucoup de voies pathogènes dans la RA humaine, y compris la production d’autoantibody, le dépôt complexe immunisé, l’activation de cellules myéloïdes, les manifestations polyarticulaires et la formation pannus avec l’infiltration immunisée synovial, sont également évidentes dans ce modèle ^5,6. Les enquêteurs ont utilisé ce modèle bien établi de la CIA pour étudier les effets des traitements anti-inflammatoires cytokine⁷. Beaucoup de produits biologiques approuvés pour les maladies auto-immunes ou inflammatoires, tels que l’anti-TNF et anti-IL-6, se sont avérés efficaces dans le modèle de la CIA^8,9.

Le profilage des interactions du système immunitaire dans le tissu synovial est crucial pour élucider les mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de la polyarthrite rhumatoïde. Dans le cadre clinique humain, une pratique courante est d’effectuer des biopsies synoviales d’aiguille sous la conduite de l’imagerie par ultrasons. Dans les milieux précliniques, la plus petite architecture des articulations murines rend les procédures de biopsie beaucoup plus difficiles, voire impossibles. Récemment, nous avons démontré l’utilisation du modèle de la CIA murine pour évaluer les combinaisons de médicaments pour avoir un impact sur les points finaux disparates et résoudre la maladie dans une approche combinatoire¹⁰. Une méthode cryogénique de pulvérisation à base de moulin de congélation a été employée pour transformer les pattes murine enflammées en poudres fines homogènes et les processus établis en aval pour extraire l’ARN et les protéines. Cette méthode protège l’ARN et les protéines contre les processus de dégrativement enzymatiques et chimiques et nous permet d’appliquer plusieurs méthodes analytiques à une seule source d’échantillon homogénéisée.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux politiques du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Janssen R-D. 1. Méthode de pulvérisation cryogénique à base de moulin à congélateur À la fin de l’étude de CIA, sacrifiez des souris avec 1.5% d’isoflurane suivi de la dislocation cervicale. Le jour du traitement des tissus, pré-réfrigérer tous les instruments (spatules, flacons de broyage, etc.) sur de …

Representative Results

Ici, nous montrons une visualisation d’image de gel représentatif de l’ARN extrait des pattes avant des souris de CIA dans la figure 2A. Le rRNA 28S et la bande de rRNA 18S indiquent que tous les échantillons ont une quantité suffisante d’ARN intact. Ensuite, nous montrons une parcelle de dispersion représentative des concentrations totales de protéines basées sur l’analyse des protéines BCA à la figure 2…

Discussion

Bien qu’il existe une forte justification scientifique pour évaluer les voies moléculaires dans les tissus synovials, de nombreux rapports sur le profilage immunitaire du modèle de la CIA maurine ont été axés sur le sang périphérique, tandis que les données d’analyse des protéines et de l’ARN des pattes enflammées sont plutôt limitées. Il y a plusieurs raisons possibles à ce biais : les articulations de la cheville murine ne sont pas plus grandes que 2 cm; les zones touchées sont constituées de tissus cut…

Materials

5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing