Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü
Summary
Dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar profillerle ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için sıvı nitrojen dondurucu değirmeni kullanarak murine patilerini işlemek için kriyojenik pulverizasyon yöntemi geliştirilmiştir. Yanıt.
Abstract
Lokal dokularda moleküler değişikliklerin profilini çıkarmak, terapötik adayların in vivo eylem mekanizmasını anlamak için çok önemlidir. Artrit araştırma alanında, birçok çalışma kemik, kıkırdak, kas, stromal hücreleri ve bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir karışımından oluşan iltihaplı eklemler üzerinde durulmuştur. Burada, iltihaplı fare patilerini kriyojenik kontrollü bir ortamda homojen toz haline getirmek için güvenilir ve sağlam bir mekanik yöntem oluşturduk. Proteomik ve transkripsiyonel uç noktaları ve lokal dokudaki ilgili hastalık yollarının moleküler karakterizasyonu için protein ve RNA lysates işlendi.
Introduction
Romatoid artrit (RA) eklemlerde kalıcı simetrik sinovit ve deri, kalp, akciğer ve göz gibi organların ekstra eklem tutulumu ile kronik sistemik inflamatuar bir hastalıktır1. Bağışıklık yanıtının sistemik bulguları insan hastalarda belirgin olmakla birlikte, RA patolojisinin özelliklerinden biri sinovyal dokuda immün hücrelerin infiltrasyonu ve sinovyal fibroblast hücrelerinin çoğalmasıdır2.
Insan RA benzer, fare kollajen indüklenen artrit (CIA) modeli sinovyal dokular ve sistemik bölmelerde aktif bağışıklık yanıtları ile güçlü doku iltihabı ortaya çıkarır. Cia modeline farklı fare suşlarının duyarlılığı Majör Histokompatibilite Kompleksi (MHC) haplotip ve antijen spesifik T hücresi ve B hücre etkileşimleri3,4bağlantılar . Buna ek olarak, otoantikor üretimi, immün kompleks birikimi, miyeloid hücre aktivasyonu, poliartiküler bulgular ve sinovyal immün infiltrasyon ile pannus oluşumu da dahil olmak üzere insan RA birçok patojenik yollar da bu modelde belirgindir 5,6. Müfettişler anti-inflamatuar sitokin tedavileri etkilerini araştırmak için bu köklü CIA modeli istihdam var7. Anti-TNFα ve anti-IL-6 gibi otoimmün veya inflamatuar hastalıklar için onaylanmış birçok biyolojik, CIA modeli nde etkili olduğu bulunmuştur8,9.
Sinovyal dokuda bağışıklık sisteminin etkileşimlerinin profilini ra patogenezi ile ilişkili moleküler mekanizmaları açıklamak için çok önemlidir. İnsan klinik ortamında, yaygın bir uygulama ultrason görüntüleme gözetiminde iğne sinovyal biyopsi yapmaktır. Preklinik ortamlarda, murine eklemlerin küçük mimarisi imkansız olmasa bile biyopsi prosedürleriçok daha zor hale getirir. Son zamanlarda, farklı uç noktaları etkilemek ve bir kombinatoryal yaklaşım10hastalığı çözmek için ilaçların kombinasyonları değerlendirmek için murine CIA modelinin kullanımını gösterdi. Bir kriyojenik dondurucu değirmen tabanlı pulverizasyon yöntemi homojen ince tozlar içine iltihaplı murine pençeleri işlemek için kullanılan ve RNA ve proteinleri ayıklamak için aşağı süreçleri kuruldu. Bu yöntem, RNA ve proteini enzimatik ve kimyasal degratif proseslerden korur ve tek bir homojenize örnek kaynağına birden fazla analitik yöntem uygulamamızı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinovyal dokularda moleküler yolları değerlendirmek için güçlü bir bilimsel mantık olmasına rağmen, murine CIA modelinin immün profilleme birçok rapor periferik kan üzerinde duruldu, iltihaplı pençeleri protein ve RNA analiz verileri oldukça sınırlıdır iken. Bu önyargı için birkaç olası nedeni vardır: murine ayak bileği eklemleri ~ 2 cm daha büyüktür; etkilenen alanlar genellikle doku öğütücüler, havaneli ve harç, silika boncuk bozulması, triturasyon veya enzimatik sindirim gibi gelen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar edith Janssen el yazması ve Navin Rao ve Jennifer Towne eleştirel inceleme için bu makalenin yayınlanmasına destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
