Summary

Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

Published: October 30, 2019
doi:

Summary

È stato sviluppato un metodo criogenico di polverizzazione per la trattamento delle zampe murine utilizzando un congelatore liquido congelatore di azoto per migliorare la resa e la qualità dell’RNA o delle proteine estratte dai tessuti e consentire l’analisi dei profili molecolari associati agli infiammatori Risposte.

Abstract

Profilare i cambiamenti molecolari nei tessuti locali è fondamentale per comprendere i meccanismi di azione dei candidati terapeutici in vivo. Nel campo della ricerca sull’artrite, molti studi si concentrano sulle articolazioni infiammate che sono composte da una complessa miscela di ossa, cartilagine, muscoli, cellule stromali e cellule immunitarie. Qui, abbiamo stabilito un metodo meccanico affidabile e robusto per interrompere le zampe di topo infiammate in campioni polverizzati omogenei in un ambiente controllato criogenicamente. Le proteine e i lysati di RNA sono stati elaborati per consentire gli endpoint proteomici e trascrittivi e la caratterizzazione molecolare delle vie di malattia rilevanti nel tessuto locale.

Introduction

L’artrite reumatoide (RA) è una malattia infiammatoria sistemica cronica con sinovite simmetriche persistenti nelle articolazioni e coinvolgimento extra articolare di organi come la pelle, il cuore, i polmoni e gli occhi1. Anche se le manifestazioni sistemiche della risposta immunitaria sono evidenti nei pazienti umani, uno dei segni distintivi della patologia RA è l’infiltrazione delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale e la proliferazione delle cellule fibroblaste sinoviali2.

Simile all’AR umana, il modello di artrite indotta dal collagene di topo (CIA) suscita una forte infiammazione tissutale con risposte immunitarie attive nei tessuti sinoviali e nei compartimenti sistemici. La suscettibilità di diversi ceppi di mouse al modello CIA si collega all’aplotipo del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) e alle interazioni specifiche delle cellule T e delle cellule B3,4. Inoltre, molte vie patogene nell’AR umana, tra cui la produzione di autoanticorpi, deposizione del complesso immunitario, attivazione delle cellule mieloidi, manifestazioni poliuacolari e formazione di pannus con infiltrazione immunitaria sinoviale, sono anche evidenti in questo modello 5,6. Gli investigatori hanno impiegato questo modello ben consolidato CIA per studiare gli effetti dei trattamenti citochini antinfiammatori7. Molti biologici omologati per le malattie autoimmuni o infiammatorie, come anti-TNF e anti-IL-6, sono trovati per essere efficace nel modello CIA8,9.

Profilare le interazioni del sistema immunitario nel tessuto sinoviale è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari associati alla patogenesi dell’AR. Nell’ambiente clinico umano, una pratica comune è quella di eseguire biopsie sinoviali dell’ago sotto la guida dell’imaging a ultrasuoni. Negli ambienti preclinici, l’architettura più piccola delle articolazioni murine rende le procedure di biopsia molto più difficili se non impossibili. Recentemente, abbiamo dimostrato l’utilizzo del modello murine CIA per valutare combinazioni di farmaci per influenzare diversi endpoint e risolvere la malattia in un approccio combinatorio10. È stato utilizzato un metodo di polverizzazione criogenico basato sul mulino a congelatore per elaborare le zampe murine infiammate in polveri fini omogenee e stabilire processi a valle per estrarre RNA e proteine. Questo metodo protegge l’RNA e le proteine dai processi degrativi enzimatici e chimici e ci consente di applicare più metodi analitici a una singola fonte di campione omogenea.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le politiche del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) della R&S di Janssen. 1. Metodo di pulverizzazione criogenico basato sul mulino congelatore Al termine dello studio della CIA, sacrificare i topi con 1.5% isoflurane seguiti da lussazione cervicale. Il giorno della lavorazione dei tessuti, preraffreddare tutti gli strumenti (spatole, fiale di macinazione, ecc.) sul ghiaccio secco …

Representative Results

Qui, mostriamo una visualizzazione dell’immagine gel rappresentativa dell’RNA estratta dalle zampe anteriori dei topi della CIA in Figura 2A. Il rRNA 28S e la banda 18S di rRNA indicano che tutti i campioni hanno una quantità sufficiente di RNA intatto. Successivamente, mostriamo un grafico a dispersione rappresentativa delle concentrazioni totali di proteine sulla base dell’analisi della proteina BCA nella figura 2</str…

Discussion

Anche se c’è una forte logica scientifica per valutare le vie molecolari nei tessuti sinoviali, molte segnalazioni sulla profilazione immunitaria del modello della CIA murina erano focalizzate sul sangue periferico, mentre i dati di analisi delle proteine e dell’RNA delle zampe infiammate sono piuttosto limitati. Ci sono diverse possibili ragioni per questo pregiudizio: le articolazioni della caviglia murina non sono più grandi di 2 cm; le aree colpite sono costituite da tessuti cutanei, ossei e connettivi che sono spe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Edith Janssen per la revisione critica del manoscritto e Navin Rao e Jennifer Towne per il loro sostegno alla pubblicazione di questo manoscritto.

Materials

5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
beta-mercaptoethanol Sigma M6250 Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit Agilent 5067-1511 RNA qualification kit
b-mercaptoethanol Sigma M6250
Cell Culture Grade Water Corning 25-055-CI Water
Cell lysis stock solution Cell Signaling 9803
Eppendorf Tube Eppendorf 22363204 Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box Nalgene 5055 Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker Benchmark Scientific BR5000
Freezer Mill Spex Sample Prep 6875 Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial Spex Sample Prep 6801 Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit Pierce 23225 Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1 Calbiochem 539131 Protease Inhibitors
Protein BCA Kit Pierce 23225
Quantigene Kit Thermofisher QP1013 bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5417R Centrifugation
RLT Buffer Qiagen 79216 RNA extraction buffer
RNeasy mini kit Qiagen 74104 including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker Benchmark Scientific BR5000 Rocker/Shaker
Spatula VWR 10806-412 Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead Qiagen 69989 Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor Spex Sample Prep 6884 Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer VWR 10153-838 Sample mixing

References

  1. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
  2. McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
  3. Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
  4. David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
  5. Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
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  7. Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
  8. Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
  9. Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
  10. Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).

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Cite This Article
Jones, B., Hitchcock, S., Loza, M., Malaviya, R., Ort, T., Shen, F. A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model. J. Vis. Exp. (152), e60229, doi:10.3791/60229 (2019).

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