Summary

Крио-распыления Протокол для обработки мышь лапы для оценки молекулярных путей воспаления тканей в коллагениндовой модели артрита

Published: October 30, 2019
doi:

Summary

Криогенный метод распыления для обработки мурин лап с помощью жидкого азота морозильной мельницы был разработан для улучшения урожайности и качества РНК или белка, извлеченного из тканей и позволяют анализ молекулярных профилей, связанных с воспалительными Ответы.

Abstract

Профилирование молекулярных изменений в местных тканях имеет решающее значение для понимания механизма (ы) действия терапевтических кандидатов in vivo. В области исследований артрита, многие исследования сосредоточены на воспаление суставов, которые состоят из сложной смеси костей, хряща, мышц, стромальных клеток и иммунных клеток. Здесь мы создали надежный и надежный механический метод для разрушения воспаленных мышей лап в однородные распыленные образцы в криогенно контролируемой среде. Белки и РНК-лизаты были обработаны для обеспечения протеомных и транскрипционных конечных точек и молекулярной характеристики соответствующих путей заболевания в местной ткани.

Introduction

Ревматоидный артрит (РА) является хроническим системным воспалительным заболеванием с стойким симметричным синовитом в суставах и дополнительным суставным участием органов, таких как кожа, сердце, легкие и глаза1. Хотя системные проявления иммунного ответа очевидны у пациентов, одной из отличительных черт патологии РА является проникновение иммунных клеток в синовиальную ткань и пролиферация синовиальных фибробластных клеток2.

Как и в человеческой РА, мышь коллагена индуцированных артрита (ЦРУ) модель вызывает сильное воспаление тканей с активными иммунными реакциями в синовиальных тканей и системных отсеков. Восприимчивость различных штаммов мыши к модели ЦРУ ссылки на основные гистосовместимости комплекса (MHC) гаплотип и антиген конкретных Т-клеток и B-клеточных взаимодействий3,4. Кроме того, многие патогенные пути в организме человека, в том числе производство аутоантител, иммунный комплекс осаждения, активация миелоидных клеток, полиартикулярные проявления и формирование паннуса с синовиальной иммунной инфильтрацией, также проявляются в этой модели 5,6. Следователи использовали эту устоявшуюся модель ЦРУ для расследования последствий противовоспалительных цитокинов лечения7. Многие биопрепараты, одобренные для аутоиммунных или воспалительных заболеваний, таких как анти-ТНФЗ и анти-IL-6, оказались эффективными в модели ЦРУ8,9.

Профилирование взаимодействий иммунной системы в синовиальной ткани имеет решающее значение для выяснения молекулярных механизмов, связанных с патогенезом РА. В клинических условиях человека, распространенная практика заключается в выполнении иглы синовиальной биопсии под руководством ультразвуковой визуализации. В доклинических условиях меньшая архитектура муринских суставов делает процедуры биопсии гораздо более сложными, если не невозможными. Недавно мы продемонстрировали использование модели murine ЦРУ для оценки комбинаций препаратов для воздействия разрозненных конечных точек и разрешения болезни в комбинаторном подходе10. Для обработки воспаленные муринные лапы в однородные мелкие порошки был использован криогенный морозильный метод мельницы на основе мельницы. Этот метод защищает РНК и белок от ферментативных и химических дегративных процессов и позволяет нам применять несколько аналитических методов к одному гомогенизированному источнику образца.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) компании «Янссен» НИОКР. 1. Криогенный морозильник мельница основе пульверизации Метод При прекращении исследования ЦРУ, жертво…

Representative Results

Здесь мы показываем репрезентативную визуализацию изображения геля РНК, извлеченную из передних лап мышей ЦРУ на рисунке 2A. 28S rRNA и диапазон 18S rRNA указывают на то, что все образцы имеют достаточное количество нетронутой РНК. Далее мы показываем…

Discussion

Хотя есть сильное научное обоснование для оценки молекулярных путей в синовиальных тканях, многие доклады об иммунном профилировании модели ЦРУ были сосредоточены на периферической крови, в то время как данные анализа белка и РНК воспаленных лап довольно ограничены. Есть несколько во…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Эдит Янссен за критический обзор рукописи и Навин Рао и Дженнифер Таун за поддержку публикации этой рукописи.

Materials

5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
beta-mercaptoethanol Sigma M6250 Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit Agilent 5067-1511 RNA qualification kit
b-mercaptoethanol Sigma M6250
Cell Culture Grade Water Corning 25-055-CI Water
Cell lysis stock solution Cell Signaling 9803
Eppendorf Tube Eppendorf 22363204 Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box Nalgene 5055 Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker Benchmark Scientific BR5000
Freezer Mill Spex Sample Prep 6875 Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial Spex Sample Prep 6801 Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit Pierce 23225 Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1 Calbiochem 539131 Protease Inhibitors
Protein BCA Kit Pierce 23225
Quantigene Kit Thermofisher QP1013 bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5417R Centrifugation
RLT Buffer Qiagen 79216 RNA extraction buffer
RNeasy mini kit Qiagen 74104 including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker Benchmark Scientific BR5000 Rocker/Shaker
Spatula VWR 10806-412 Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead Qiagen 69989 Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor Spex Sample Prep 6884 Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer VWR 10153-838 Sample mixing

References

  1. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
  2. McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
  3. Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
  4. David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
  5. Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
  6. Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
  7. Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
  8. Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
  9. Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
  10. Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).

Play Video

Cite This Article
Jones, B., Hitchcock, S., Loza, M., Malaviya, R., Ort, T., Shen, F. A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model. J. Vis. Exp. (152), e60229, doi:10.3791/60229 (2019).

View Video