Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

Summary

Se desarrolló un método de pulverización criogénica para procesar patas murinas utilizando un molino congelador de nitrógeno líquido para mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con Respuestas.

Abstract

La elaboración de perfiles de cambios moleculares en los tejidos locales es crucial para comprender los mecanismos de acción de los candidatos terapéuticos in vivo. En el campo de la investigación de la artritis, muchos estudios se centran en las articulaciones inflamadas que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, células estromales y células inmunitarias. Aquí, establecimos un método mecánico fiable y robusto para interrumpir las patas de ratón inflamadas en muestras pulverizadas homogéneas en un entorno croogénicamente controlado. Se procesaron lelíforos de proteínas y ARN para permitir las variables proteómicas y transcripcionales y la caracterización molecular de las vías de enfermedad relevantes en el tejido local.

Introduction

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica con sinovitis simétrica persistente en las articulaciones y afectación articular adicional de órganos como la piel, el corazón, los pulmones y los ojos¹. Aunque las manifestaciones sistémicas de la respuesta inmunitaria son evidentes en pacientes humanos, una de las señas de identidad de la patología de la AR es la infiltración de células inmunitarias en el tejido sinovial y la proliferación de células fibroblastos sinoviales².

Al igual que la AR humana, el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón (CIA) provoca una fuerte inflamación del tejido con respuestas inmunitarias activas en tejidos sinoviales y compartimentos sistémicos. La susceptibilidad de diferentes cepas de ratón a los enlaces del modelo CIA a los principales haplotipos del Complejo histocompatibilidad (MHC) y las interacciones específicas del antígeno T y de la célula B^3,4. Además, muchas vías patógenas en la AR humana, incluyendo la producción de autoanticuerpos, deposición del complejo inmune, activación de células mieloides, manifestaciones poliarticulares y formación de pannus con infiltración inmune sinovial, también son evidentes en este modelo ^5,6. Los investigadores han empleado este modelo bien establecido de la CIA para investigar los efectos de los tratamientos antiinflamatorios de citoquinas⁷. Muchos productos biológicos aprobados para enfermedades autoinmunes o inflamatorias, tales como anti-TNF y anti-IL-6, se encuentran para ser eficaces en el modelo de la CIA^8,9.

La elaboración de perfiles de las interacciones del sistema inmunitario en el tejido sinovial es crucial para dilucidar los mecanismos moleculares asociados con la patogénesis de la AR. En el entorno clínico humano, una práctica común es realizar biopsias sinoviales de aguja bajo la guía de imágenes por ultrasonido. En los entornos preclínicos, la arquitectura más pequeña de las articulaciones murinas hace que los procedimientos de biopsia sean mucho más difíciles si no imposibles. Recientemente, demostramos la utilización del modelo de la CIA murina para evaluar combinaciones de fármacos para impactar puntos finales dispares y resolver enfermedades en un enfoque combinatorio^10. Se empleó un método de pulverización a base de molino de congelador criogénico para procesar patas murinos inflamadas en polvos finos homogéneos y estableció procesos aguas abajo para extraer ARN y proteínas. Este método protege el ARN y las proteínas de los procesos de degrativos enzimáticos y químicos y nos permite aplicar múltiples métodos analíticos a una sola fuente de muestra homogeneizada.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Janssen I+D. 1. Método de pulverización a base de molino de congelador criogénico Al finalizar el estudio de la CIA, sacrificar ratones con 1.5% de isoflurano seguido de dislocación cervical. El día del procesamiento de tejidos, enfríe previamente todos los instrumentos (espátulas, viales de molienda, etc.) sobre hielo…

Representative Results

Aquí, mostramos una visualización representativa de la imagen de gel de ARN extraído de las patas delanteras de los ratones de la CIA en la Figura 2A. El ARNm 28S y la banda rRNA 18S indican que todas las muestras tienen una cantidad suficiente de ARN intacto. A continuación, mostramos una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones totales de proteínas basadas en el análisis de proteína BCA en la…

Discussion

Aunque existe una sólida lógica científica para evaluar las vías moleculares en los tejidos sinoviales, muchos informes sobre el perfil inmune del modelo de la CIA murina se centraron en la sangre periférica, mientras que los datos de análisis de proteínas y ARN de las patas inflamadas son bastante limitados. Hay varias razones posibles para este sesgo: las articulaciones del tobillo murino no son más grandes que 2 cm; las zonas afectadas consisten en piel, hueso y tejidos conectivos que a menudo son difíciles d…

Materials

5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing