Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis
Summary
Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.
Abstract
Profilering van moleculaire veranderingen in lokale weefsels is van cruciaal belang om het mechanisme (s) van de therapeutische kandidaten in vivo te begrijpen. Op het gebied van artritis Research, veel studies zijn gericht op ontstoken gewrichten die zijn samengesteld uit een complex mengsel van bot, kraakbeen, spier, stromale cellen en immuuncellen. Hier hebben we een betrouwbare en robuuste mechanische methode opgezet om ontstoken muis poten te verstoren in homogene verpulverd monsters in een cryogene gecontroleerde omgeving. Eiwit en RNA lysaten werden verwerkt om Proteomic en transcriptionele eindpunten en moleculaire karakterisering van relevante ziekte trajecten in lokaal weefsel mogelijk te maken.
Introduction
Reumatoïde artritis (RA) is een chronische systemische ontstekingsziekte met aanhoudende symmetrische inflammatoire in gewrichten en extra articulaire betrokkenheid van organen zoals de huid, hart, longen en ogen1. Hoewel de systemische manifestaties van de immuunrespons duidelijk zijn bij menselijke patiënten, is een van de kenmerken van RA pathologie infiltratie van immuuncellen in synoviale weefsels en proliferatie van synoviale fibroblast-cellen2.
Net als bij Human RA, ontlokte muis collageen geïnduceerde artritis (CIA) model sterke ontsteking van het weefsel met actieve immuunresponsen in synoviale weefsels en systemische compartimenten. De gevoeligheid van verschillende muis stammen naar CIA model links naar Major histocompatibility complex (MHC) Haplotype en antigeen specifieke T cel en B celinteracties3,4. Bovendien zijn veel pathogene trajecten in menselijke RA, met inbegrip van de productie van autoantilichamen, immuun complexe depositie, myeloïde celactivering, polyarticulaire manifestaties en pannus vorming met synoviale immuuninfiltratie, ook duidelijk in dit model 5,6. Onderzoekers hebben dit gevestigde CIA-model gebruikt om de effecten van ontstekingsremmende cytokine-behandelingen te onderzoeken7. Veel Biologics die zijn goedgekeurd voor auto-immune of ontstekingsziekten, zoals anti-tnfα en anti-Il-6, bleken werkzaam te zijn in het CIA-model8,9.
Profilering van de interacties van het immuunsysteem in synoviale weefsel is cruciaal om te verhelmaken moleculaire mechanismen geassocieerd met de pathogenese van RA. In de humane klinische setting is een gebruikelijke praktijk om naald synoviale biopsieën uit te voeren onder leiding van echografie. In de preklinische instellingen maakt de kleinere architectuur van de Murine gewrichten biopsie procedures veel moeilijker, zo niet onmogelijk. Onlangs toonden we het gebruik van het Murine CIA-model om combinaties van geneesmiddelen te evalueren om verschillende eindpunten te beïnvloeden en de ziekte op te lossen in een combinatorische aanpak10. Een cryogene Vries molen gebaseerde pulverisatie methode werd gebruikt om ontstoken muriene poten te verwerken in homogene fijne poeders en stroomafwaarts processen om RNA en eiwitten te extraheren. Deze methode beschermt RNA en eiwitten tegen enzymatische en chemische degratieve processen en stelt ons in staat om meerdere analytische methoden toe te passen op een enkele gehomogeniseerde monsterbron.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel er een sterke wetenschappelijke onderbouwing is om moleculaire trajecten in synoviale weefsels te evalueren, waren veel rapporten over immuun profilering van het Murine CIA-model gericht op perifeer bloed, terwijl eiwit-en RNA-analysegegevens van ontstoken poten vrij beperkt zijn. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor deze bias: Murine enkelgewrichten zijn niet groter dan ~ 2 cm; de aangetaste gebieden bestaan uit huid, botten en bindweefsels die vaak moeilijk te homogeniseren zijn met behulp van traditione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Edith Janssen bedanken voor de kritische beoordeling van het manuscript en Navin Rao en Jennifer Towne voor hun steun aan de publicatie van dit manuscript.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
