نهج فريد لعزل العدلات نخاع عظم الفئران بسعة مماثلة
Summary
يحدد هذا البحث تقنيتين لعزل مصائد العدلات خارج الخلية الوفيرة (NETs) من نخاع عظم الفئران. تجمع إحدى الطرق بين مجموعة عزل العدلات التجارية والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الطرد المركزي المتدرج للكثافة فقط. كلا النهجين يتمخضان عن شبكات وظيفية تفوق تلك الموجودة في العدلات الدموية المحيطية.
Abstract
كان الهدف الأساسي من هذا البحث هو تطوير نهج موثوق وفعال لعزل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) من نخاع عظم الفئران. نشأ هذا الجهد بسبب القيود المرتبطة بالطريقة التقليدية لاستخراج الشبكات من الدم المحيطي ، ويرجع ذلك أساسا إلى ندرة العدلات المتاحة للعزل. كشفت الدراسة عن منهجيتين متميزتين للحصول على العدلات الفئران من نخاع العظام: إجراء مبسط من خطوة واحدة أسفر عن مستويات تنقية مرضية ، وعملية من خطوتين أكثر كثافة للوقت أظهرت كفاءة تنقية معززة. الأهم من ذلك ، أن كلتا التقنيتين أسفرت عن كمية كبيرة من العدلات القابلة للحياة ، تتراوح بين 50 إلى 100 مليون لكل فئران. عكست هذه الكفاءة النتائج التي تم الحصول عليها من عزل العدلات من كل من المصادر البشرية والفئران. بشكل ملحوظ ، أظهرت العدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران قدرات مماثلة لإفراز الشبكات عند مقارنتها بالعدلات التي تم الحصول عليها من الدم المحيطي. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على نخاع العظم أنتجت باستمرار كميات أكبر بشكل ملحوظ من كل من العدلات و NETs. أظهر هذا النهج إمكانية الحصول على كميات أكبر بكثير من هذه المكونات الخلوية لمزيد من التطبيقات النهائية. والجدير بالذكر أن هذه الشبكات المعزولة والعدلات تبشر بمجموعة من التطبيقات ، تغطي مجالات الالتهاب والعدوى وأمراض المناعة الذاتية.
Introduction
تشكل العدلات مجموعة فرعية حرجة من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية الفطرية. وهي تتميز بنوى وحبيبات متعددة الفصوص تحتوي على مختلف البروتياز والببتيدات المضادة للميكروبات1. تعمل العدلات بشكل أساسي من خلال التحلل ، البلعمة ، وتشكيل NETs. تم إجراء ملاحظة الشبكات لأول مرة بواسطة Takei et al. في عام 1996 خلال تجربة حيث تم تحفيز العدلات باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA) 2. في وقت لاحق ، تمت صياغة عملية تكوين NET “NETosis” بواسطة Brinkmann et al.3 في عام 2004. سلط بحثهم الضوء على الدور الحاسم لشبكات NETs في استجابات مضادات الميكروبات بوساطة العدلات. الشبكات عبارة عن هياكل تشبه الويب تتكون من الكروماتين والهستونات والبروتينات المضادة للميكروبات التي يتم إطلاقها من العدلات المنشطة استجابة للمحفزات المعدية والالتهابية. يمكن للشبكات شل حركة وقتل مسببات الأمراض الغازية عن طريق محاصرتها وتعريضها لتركيز عال من الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1,3. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم الشبكات في إزالة الخلايا المبرمج والمشاركة في حل الالتهاب. تشير الدراسات الحديثة أيضا إلى أن التكوين المفرط للشبكات أو ضعف تدهور الشبكة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة ، واضطرابات المناعة الذاتية ، وتكوين الجلطات ، وضعف إعادة التوعي4،5،6،7،8،9،10.
تم إثبات الدور الممرض للشبكات في التليف غير المنضبط بعد احتشاء عضلة القلب وتشكيل تمدد الأوعية الدموية البطيني من خلال توسيع التليف حول الأوعية الدموية4،11. نموذج احتشاء عضلة القلب وعزل العدلات من نخاع العظام في الفئران كلاهما راسخ. الكريات البيض متعددة الأشكال (PMN) ، وهي نوع من خلايا الدم البيضاء الوفيرة في دم الإنسان ، بمثابة مصدر ممتاز لعزل العدلات البشرية. هذه الطريقة تلغي الحاجة إلى حصاد نخاع العظام ، وبالتالي تعزيز السلامة والكفاءة.
تلعب الشبكات أيضا دورا في الرجفان الأذيني المرتبط بإعادة تشكيل القلب. ومع ذلك ، تم استخدام الكبيرة مثل والخنازير لنمذجة الرجفان الأذيني ، حيث تفتقر الفئران إلى الأذين الكبير بما يكفي لإنشاء دورة إعادة الدخول أو نموذج AF ، ما لم يتم هدم أو طرق إشارات محددة أو طردها12. في حين أنه من الممكن إحداث الرجفان الأذيني في الفئران وعزل العدلات من الدم المحيطي للفئران كما هو موضح سابقا ، واجه الباحثون قيدا حيث يمكن عزل 2 × 105-5 × 105 عدلات فقط من الدم المحيطي (10 مل لكل فئران). يتطلب استخراج شبكات كافية في كل نقطة زمنية ما يقرب من 10-25 فأرا (5 × 106 عدلات في المجموع) ، مما يؤدي إلى عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغالبا ما تكون منخفضة الغلة13. في هذا الصدد ، يقدم Li He وزملاؤه استراتيجية موجهة نحو نخاع العظام للحصول على شبكات كافية من الفئران14. في مقالتهم ، يقدمون وصفا شاملا لعزل العدلات من نخاع عظم الفئران ومقارنة قدرات إفراز NET للعدلات الطرفية ونخاع العظم في الفئران. تلبي الطريقتان التوضيحيتان أهدافا تجريبية متميزة ، وكلاهما ينتج عنه كميات كافية من العدلات في نخاع عظم الفئران مع تقليل عدد الفئران المطلوبة. أظهرت طريقة العزل المكونة من خطوتين تنقية فائقة للعدلات ، بينما أثبتت الطريقة المكونة من خطوة واحدة كفاءتها من حيث الوقت مع مستويات تنقية مقبولة. علاوة على ذلك ، قارن الباحثون NETosis وتشكيل NET بين العدلات في نخاع عظم الفئران ونظيراتها المحيطية ، ووجدوا قوة متساوية مع PMN. تساهم هذه النتائج بشكل كبير في الدراسات المتعلقة بالعدلات حول الرجفان الأذيني وتؤكد على أهمية الاختيار المرن لمصادر مختلفة لعزل العدلات في التجارب المختلفة ذات توزيعات العدلات المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشكل عزل العدلات خطوة محورية في دراسة NETosis ، حيث يكون اختيار طريقة العزل المناسبة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. أحد العوامل المهمة التي يجب وزنها هو حدوث تلوث الخلايا اللمفاوية أثناء العزل. تعتبر معالجة هذا التحدي مهمة بشكل خاص عند عزل عدلات الفئران عن نخاع العظا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام 82004154 و 81900311 و 82100336 و 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
