גישה ייחודית לבידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה עם קיבולת דומה
Summary
מחקר זה מתאר שתי טכניקות לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בשפע ממח עצם של חולדה. שיטה אחת משלבת ערכת בידוד נויטרופילים מסחרית עם צנטריפוגת שיפוע צפיפות, ואילו השנייה משתמשת רק בצנטריפוגה שיפוע צפיפות. שתי הגישות מניבות NETs פונקציונליים העולים על אלה של נויטרופילים היקפיים בדם.
Abstract
המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לפתח גישה אמינה ויעילה לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) ממח עצם של חולדה. מאמץ זה נבע ממגבלות הקשורות לשיטה המסורתית של חילוץ NETs מדם היקפי, בעיקר בשל המחסור בנויטרופילים זמינים לבידוד. המחקר חשף שתי מתודולוגיות שונות להשגת נויטרופילים של חולדות ממח עצם: הליך יעיל בן שלב אחד שהניב רמות טיהור משביעות רצון, ותהליך דו-שלבי גוזל זמן רב יותר שהציג יעילות טיהור משופרת. חשוב לציין ששתי הטכניקות הניבו כמות משמעותית של נויטרופילים בני קיימא, בטווח שבין 50 ל-100 מיליון לכל חולדה. יעילות זו שיקפה את התוצאות שהתקבלו מבידוד נויטרופילים הן ממקורות אנושיים והן ממקורות מורינים. באופן משמעותי, נויטרופילים שמקורם במח עצם של חולדה הפגינו יכולות דומות להפריש NETs בהשוואה לנויטרופילים שהתקבלו מדם היקפי. עם זאת, השיטה המבוססת על מח עצם ייצרה באופן עקבי כמויות גדולות יותר הן של נויטרופילים והן של NETs. גישה זו הדגימה את הפוטנציאל להשיג כמויות גדולות יותר באופן משמעותי של רכיבים תאיים אלה עבור יישומים נוספים במורד הזרם. יש לציין כי רשתות ונויטרופילים מבודדים אלה טומנים בחובם הבטחה למגוון יישומים, המשתרעים על פני תחומי הדלקת, הזיהום והמחלות האוטואימוניות.
Introduction
נויטרופילים מהווים תת-קבוצה קריטית של לויקוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית המולדת. הם מאופיינים גרעינים מרובי אונות וגרגירים המכילים פרוטאזות שונות ופפטידים מיקרוביאליים1. נויטרופילים מתפקדים בעיקר באמצעות דה-גרנולציה, פגוציטוזה והיווצרות רשתות חשמל. התצפית של NETs נעשתה לראשונה על ידי Takei et al. בשנת 1996 במהלך ניסוי שבו נויטרופילים היו מגורים עם phorbol myristate אצטט (PMA)2. לאחר מכן, תהליך היווצרות הרשת נטבע “NETosis” על ידי Brinkmann et al.3 בשנת 2004. המחקר שלהם האיר עוד יותר את התפקיד המכריע של NETs בתגובות מיקרוביאליות בתיווך נויטרופילים. NETs הם מבנים דמויי רשת המורכבים מכרומטין, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים המשתחררים מנויטרופילים פעילים בתגובה לגירויים זיהומיים ודלקתיים. רשתות יכולות לשתק ולהרוג פתוגנים פולשים על ידי לכידתם וחשיפתם לריכוז גבוה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ופרוטאזות 1,3. בנוסף, NETs תורמים לסילוק תאים אפופטוטיים ומשתתפים ברזולוציית דלקת. מחקרים אחרונים מצביעים גם על כך שהיווצרות מוגזמת של NETs או פגיעה בפירוק הרשת עלולה להוביל לנזק לרקמות, הפרעות אוטואימוניות, טרומבוגנזה ופגיעה ברה-וסקולריזציה 4,5,6,7,8,9,10.
התפקיד הפתוגני של NETs בפיברוזיס בלתי מבוקר לאחר אוטם שריר הלב והיווצרות מפרצות חדריות הוכח באמצעות הרחבת פיברוזיס פריווסקולרי 4,11. מודל אוטם שריר הלב והבידוד של נויטרופילים ממח עצם בעכברים מבוססים היטב. לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMN), סוג של תאי דם לבנים המצויים בשפע בדם אנושי, משמשים כמקור מצוין לבידוד נויטרופילים אנושיים. שיטה זו מבטלת את הצורך לקצור מח עצם, ובכך משפרת את הבטיחות והיעילות.
NETs גם לשחק תפקיד בפרפור פרוזדורים הקשורים שיפוץ הלב. עם זאת, בעלי חיים גדולים כגון כלבים וחזירים נוצלו כדי למדל פרפור פרוזדורים, מכיוון שלעכברים אין אטריום גדול מספיק כדי ליצור מחזור כניסה מחדש או מודל AF, אלא אם כן תעלות יונים ספציפיות או מסלולי איתות הופלו או הושמדו12. בעוד שניתן לגרום לפרפור פרוזדורים בחולדות ולבודד נויטרופילים מדם היקפי של חולדות כפי שתואר קודם לכן, החוקרים נתקלו במגבלה לפיה ניתן לבודד רק 2 x 105-5 x 10 5 נויטרופילים מדם היקפי (10 מ”ל לחולדה). חילוץ מספיק NETs בכל נקודת זמן דרש בערך 10-25 חולדות (5 x 106 נויטרופילים בסך הכל), וכתוצאה מכך תהליך גוזל זמן, יקר, ולעתים קרובות תפוקה נמוכה13. בהקשר זה, לי הא ועמיתיו מציגים אסטרטגיה מוכוונת מח עצם להשגת רשתות נאותות מחולדות14. במאמרם הם מספקים תיאור מקיף של בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה ומשווים את יכולות הפרשת NET של נויטרופילים היקפיים ומח עצם של חולדות. שתי השיטות המתוארות מספקות מטרות ניסוי נפרדות, ושתיהן מביאות לכמויות מספיקות של נויטרופילים ממח עצם של חולדה תוך הפחתת מספר החולדות הדרושות. שיטת הבידוד הדו-שלבי הדגימה טיהור נויטרופילים מעולה, בעוד ששיטת הצעד האחד הוכיחה את עצמה כיעילה בזמן עם רמות טיהור מקובלות. יתר על כן, החוקרים השוו NETosis והיווצרות NET בין נויטרופילים של מח עצם חולדה לבין עמיתיהם ההיקפיים, ומצאו עוצמה שווה עם PMN. ממצאים אלה תורמים באופן משמעותי למחקרים הקשורים לנויטרופילים על פרפור פרוזדורים ומדגישים את החשיבות של בחירה גמישה של מקורות שונים לבידוד נויטרופילים בחיות ניסוי שונות עם התפלגות נויטרופילים שונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד הנויטרופילים מהווה צעד מכריע בחקר NETosis, שבו בחירת שיטת בידוד מתאימה היא בעלת חשיבות עליונה להשגת תוצאות אמינות. גורם חשוב לשקול הוא התרחשות של זיהום לימפוציטים במהלך הבידוד. התמודדות עם אתגר זה משמעותית במיוחד כאשר מבודדים נויטרופילים של חולדות ממח העצם. למרות טווח הצפיפות המובהק ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון: עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס’ 82004154, 81900311, 82100336 ו-81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
