Einzigartiger Ansatz zur Isolierung von Neutrophilen im Knochenmark von Ratten mit vergleichbarer Kapazität

Summary

Diese Forschung skizziert zwei Techniken zur Isolierung reichlich neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten. Eine Methode kombiniert ein kommerzielles Neutrophilen-Isolationskit mit einer Dichtegradientenzentrifugation, während die andere nur eine Dichtegradientenzentrifugation verwendet. Beide Ansätze liefern funktionelle NETs, die die von peripheren Blutneutrophilen übertreffen.

Abstract

Das Hauptziel dieser Forschung war es, einen zuverlässigen und effizienten Ansatz zur Isolierung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten zu entwickeln. Diese Bemühungen ergaben sich aus Einschränkungen im Zusammenhang mit der traditionellen Methode zur Extraktion von NETs aus peripherem Blut, hauptsächlich aufgrund des Mangels an verfügbaren Neutrophilen für die Isolierung. Die Studie ergab zwei unterschiedliche Methoden zur Gewinnung von Rattenneutrophilen aus dem Knochenmark: ein optimiertes einstufiges Verfahren, das zufriedenstellende Reinigungswerte ergab, und ein zeitintensiveres zweistufiges Verfahren, das eine verbesserte Reinigungseffizienz aufwies. Wichtig ist, dass beide Techniken eine beträchtliche Menge lebensfähiger Neutrophilen ergaben, die zwischen 50 und 100 Millionen pro Ratte lag. Diese Effizienz spiegelte die Ergebnisse wider, die bei der Isolierung von Neutrophilen sowohl aus menschlichen als auch aus murinen Quellen erzielt wurden. Bezeichnenderweise zeigten Neutrophile aus Rattenknochenmark vergleichbare Fähigkeiten zur Sekretion von NETs im Vergleich zu Neutrophilen, die aus peripherem Blut gewonnen wurden. Die knochenmarkbasierte Methode produzierte jedoch durchweg deutlich größere Mengen sowohl von Neutrophilen als auch von NETs. Dieser Ansatz zeigte das Potenzial, deutlich größere Mengen dieser zellulären Komponenten für weitere nachgelagerte Anwendungen zu gewinnen. Insbesondere diese isolierten NETs und Neutrophilen sind vielversprechend für eine Reihe von Anwendungen, die sich über Entzündungen, Infektionen und Autoimmunerkrankungen erstrecken.

Introduction

Neutrophile stellen eine kritische Untergruppe von Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunantwort spielen. Sie zeichnen sich durch mehrlappige Kerne und Granula aus, die verschiedene Proteasen und antimikrobielle Peptide enthalten¹. Neutrophile funktionieren hauptsächlich durch Degranulation, Phagozytose und die Bildung von NETs. Die Beobachtung von NETs wurde erstmals 1996 von Takei et al. während eines Experiments durchgeführt, bei dem Neutrophile mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert ^wurden2. In der Folge wurde der Prozess der NET-Bildung 2004 von Brinkmann et ^al.3 als “NETosis” bezeichnet. Ihre Forschung beleuchtete die entscheidende Rolle von NETs bei neutrophilenvermittelten antimikrobiellen Reaktionen. NETs sind netzartige Strukturen, die aus Chromatin, Histonen und antimikrobiellen Proteinen bestehen, die als Reaktion auf infektiöse und entzündliche Reize von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden. NETs können eindringende Krankheitserreger immobilisieren und abtöten, indem sie sie einfangen und einer hohen Konzentration an antimikrobiellen Peptiden und Proteasen aussetzen ^1,3. Darüber hinaus tragen NETs zur Beseitigung apoptotischer Zellen bei und sind an der Auflösung von Entzündungen beteiligt. Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass eine übermäßige Bildung von NETs oder ein beeinträchtigter NET-Abbau zu Gewebeschäden, Autoimmunerkrankungen, Thrombogenese und beeinträchtigter Revaskularisierung führen kann 4,5,6,7,8,9,10.

Die pathogene Rolle von NETs bei unkontrollierter Fibrose nach Myokardinfarkt und der Bildung ventrikulärer Aneurysmen wurde durch die Ausbreitung der perivaskulären Fibrose nachgewiesen ^4,11. Das Myokardinfarktmodell und die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark bei Mäusen sind beide gut etabliert. Polymorphkernige (PMN) Leukozyten, eine Art weißer Blutkörperchen, die im menschlichen Blut reichlich vorhanden sind, dienen als hervorragende Quelle für die Isolierung menschlicher Neutrophile. Diese Methode macht die Entnahme von Knochenmark überflüssig und erhöht so die Sicherheit und Effizienz.

NETs spielen auch eine Rolle bei Vorhofflimmern im Zusammenhang mit dem kardialen Umbau. Große Tiere wie Hunde und Schweine wurden jedoch verwendet, um Vorhofflimmern zu modellieren, da Mäusen ein Vorhof fehlt, der groß genug ist, um einen Wiedereintrittszyklus oder das AF-Modell zu etablieren, es sei denn, bestimmte Ionenkanäle oder Signalwege werden ausgeschaltet oder ausgeschaltet¹². Während es möglich ist, Vorhofflimmern bei Ratten zu induzieren und Neutrophile aus dem peripheren Blut von Ratten zu isolieren, stießen die Forscher auf eine Einschränkung, bei der nur 2 x 10^5-5 x 10⁵ Neutrophile aus peripherem Blut isoliert werden konnten (10 ml pro Ratte). Die Extraktion ausreichender NETs zu jedem Zeitpunkt erforderte etwa 10-25 Ratten (insgesamt 5 x 10⁶ Neutrophile), was zu einem zeitaufwändigen, teuren und oft ertragsarmen Prozess führte¹³. In diesem Zusammenhang stellen Li He und Kollegen eine knochenmarkorientierte Strategie vor, um adäquate NETs von Ratten^{zu erhalten 14}. In ihrem Artikel beschreiben sie umfassend die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Ratten und vergleichen die NET-Sekretionsfähigkeiten von peripheren und Knochenmark-Neutrophilen von Ratten. Die beiden beschriebenen Methoden dienen unterschiedlichen experimentellen Zielen, die beide zu ausreichenden Mengen an Neutrophilen im Knochenmark von Ratten führen und gleichzeitig die Anzahl der erforderlichen Ratten reduzieren. Die zweistufige Isolierungsmethode zeigte eine überlegene Neutrophilenreinigung, während sich die einstufige Methode bei akzeptablen Reinigungswerten als zeiteffizient erwies. Darüber hinaus verglichen die Forscher NETose und NET-Bildung zwischen Rattenknochenmark-Neutrophilen und ihren peripheren Gegenstücken und fanden die gleiche Wirksamkeit wie PMN. Diese Ergebnisse tragen wesentlich zu neutrophilenbezogenen Studien zu Vorhofflimmern bei und unterstreichen die Bedeutung der flexiblen Auswahl verschiedener Quellen für die Neutrophilenisolierung bei verschiedenen Versuchstieren mit unterschiedlichen Neutrophilenverteilungen.

Protocol

Die Studie wurde im Rahmen einer Projektlizenz (Nr. 20211404A) durchgeführt, die vom Tierethikkomitee des West China Hospital, Sichuan University, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Ethics Committee des West China Hospital, Sichuan University, für die Pflege und Verwendung von Tieren erteilt wurde. In Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien wurden die in dieser Studie verwendeten Ratten in einer kontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, einer Temperatur von 22-24 °C und ein…

Representative Results

Das hierin beschriebene Protokoll beschreibt zwei verschiedene Methoden, die jeweils durch eine verbesserte Reinigung oder optimierte Schritte gekennzeichnet sind. Beide Methoden ergaben ungefähr 0,5 x 108-1 x 108 Neutrophile pro Ratte. Die Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung des Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Detektionskits zeigte eine Zellviabilität von über 90 %, vergleichbar mit Maus- und menschlichen Gegenstücken (Abbildung 1). Während eine Lymphozytenko…

Discussion

Die Isolierung von Neutrophilen stellt einen entscheidenden Schritt bei der Untersuchung der NETose dar, bei dem die Auswahl einer geeigneten Isolationsmethode von größter Bedeutung ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Ein wichtiger Faktor, den es abzuwägen gilt, ist das Auftreten einer Lymphozytenkontamination während der Isolierung. Die Bewältigung dieser Herausforderung ist besonders wichtig, wenn Rattenneutrophile aus dem Knochenmark isoliert werden. Trotz des ausgeprägten Dichtebereichs von Neutrophil…

Materials

A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100