分离具有相当容量的大鼠骨髓中性粒细胞的独特方法

Summary

这项研究概述了从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的两种技术。一种方法将商用中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心相结合，而另一种方法仅采用密度梯度离心。这两种方法产生的功能性神经内分泌瘤都超过了外周血中性粒细胞。

Abstract

这项研究的主要目的是开发一种可靠有效的方法，用于从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外陷阱 （NET）。这种努力是由于与从外周血中提取NET的传统方法相关的局限性而产生的，主要是由于可用于分离的中性粒细胞稀缺。该研究揭示了从骨髓中获取大鼠中性粒细胞的两种不同方法：一种是简化的一步法，可产生令人满意的纯化水平，另一种是更耗时的两步法，其纯化效率更高。重要的是，这两种技术都产生了大量的活中性粒细胞，每只大鼠在5000万到1亿之间。这种效率反映了从人类和小鼠来源分离中性粒细胞所获得的结果。值得注意的是，与从外周血中获得的中性粒细胞相比，来自大鼠骨髓的中性粒细胞表现出相当的分泌NET的能力。然而，基于骨髓的方法始终产生大量中性粒细胞和神经内分泌瘤。这种方法证明了获得更多数量的这些细胞成分用于进一步下游应用的潜力。值得注意的是，这些分离的神经内分泌瘤和中性粒细胞有望用于一系列应用，涵盖炎症、感染和自身免疫性疾病领域。

Introduction

中性粒细胞是白细胞的一个关键亚群，在先天免疫反应中起着关键作用。它们的特征是含有各种蛋白酶和抗菌肽的多叶细胞核和颗粒¹。中性粒细胞主要通过脱颗粒、吞噬作用和神经内分泌瘤的形成发挥作用。1996 年，Takei 等人在用肉豆蔻酸佛波醇酯 （PMA） ^刺激中性粒细胞的实验中首次观察到了 NET。随后，Brinkmann 等人 ³ 在 2004 年创造了 NET 形成过程“NETosis”。他们的研究进一步阐明了NETs在中性粒细胞介导的抗菌反应中的关键作用。NET是由染色质、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，这些蛋白在感染和炎症刺激下从活化的中性粒细胞中释放出来。NET可以通过捕获入侵的病原体并将其暴露于高浓度的抗菌肽和蛋白酶来固定和杀死入侵的病原体^1,3。此外，神经内分泌瘤有助于细胞凋亡的清除并参与炎症消退。最近的研究还表明，神经内分泌瘤的过度形成或神经内分泌瘤降解受损可导致组织损伤、自身免疫性疾病、血栓形成和血运重建受损4,5,6,7,8,9,10。

NETs在心肌梗死后不受控制的纤维化和室性动脉瘤形成中的致病作用已通过血管周围纤维化的扩展得到证实^4,11。心肌梗死模型和从小鼠骨髓中分离中性粒细胞都是公认的。多形核 （PMN） 白细胞是一种富含人体血液的白细胞，是分离人类中性粒细胞的极好来源。这种方法消除了采集骨髓的需要，从而提高了安全性和效率。

神经内分泌瘤在与心脏重塑相关的心房颤动中也起作用。然而，大型动物（如狗和猪）被用来模拟心房颤动，因为小鼠缺乏足够大的心房来建立折返周期或AF模型，除非特定的离子通道或信号通路被敲低或敲除¹²。虽然如前所述，可以在大鼠中诱导心房颤动并从大鼠外周血中分离中性粒细胞，但研究人员遇到了一个限制，即只能从外周血中分离出 2 x 10^5-5 x 10^{5 中} 性粒细胞（每只大鼠 10 mL）。在每个时间点提取足够的 NET 需要大约 10-25 只大鼠（总共 5 x 10⁶ 个中性粒细胞），导致耗时、昂贵且通常产量低的过程¹³。在这方面，Li He及其同事提出了一种以骨髓为导向的策略，以从大鼠中获得足够的^NETs14。在他们的文章中，他们全面描述了从大鼠骨髓中分离中性粒细胞，并比较了大鼠外周和骨髓中性粒细胞的NET分泌能力。概述的两种方法迎合了不同的实验目标，都产生了足够数量的大鼠骨髓中性粒细胞，同时减少了所需大鼠的数量。两步分离法的中性粒细胞纯化性能优异，而一步法则在可接受的纯化水平下具有时间效率。此外，研究人员比较了大鼠骨髓中性粒细胞与其外周对应物之间的NETosis和NET形成，发现与PMN的效力相同。这些发现对心房颤动的中性粒细胞相关研究做出了重大贡献，并强调了在具有不同中性粒细胞分布的各种实验动物中灵活选择不同来源进行中性粒细胞分离的重要性。

Protocol

该研究是在四川大学华西医院动物伦理委员会授予的项目许可（编号20211404A）下进行的，符合四川大学华西医院动物伦理委员会关于动物护理和使用的指南。根据伦理准则，本研究中使用的大鼠保持在受控环境中，光/暗循环为12小时，温度为22-24°C，湿度为50%-60%。老鼠可以随意获得食物和水。本研究中使用的动物是 6-8 周龄的 Sprague Dawley （SD） 雄性大鼠，体重约 250 g，无特定病原体。这些动物是?…

Representative Results

本文概述的方案描述了两种不同的方法，每种方法都以改进的纯化或简化的步骤为特征。两种方法每只大鼠产生约0.5 x 108-1 x 108 中性粒细胞。采用膜联蛋白 V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒进行流式细胞术分析，细胞活力超过 90%，与小鼠和人类细胞活力相当（图 1）。虽然在从骨髓中分离中性粒细胞的过程中，淋巴细胞污染似乎是不可避免的，但与一步法的 50% ?…

Discussion

中性粒细胞的分离是研究NETosis的关键步骤，其中选择适当的分离方法对于获得可靠的结果至关重要。需要权衡的一个重要因素是分离过程中淋巴细胞污染的发生。在从骨髓中分离大鼠中性粒细胞时，应对这一挑战尤为重要。尽管中性粒细胞（1.0814-1.0919，峰值为1.0919）与淋巴细胞（1.0337-1.0765，峰值为1.0526）相比具有不同的密度范围，但淋巴细胞污染仍然不可避免。这在一定程度上可以归因于骨髓?…

Materials

A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100