비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법
Summary
이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.
Abstract
이 연구의 주요 목표는 쥐 골수에서 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 접근 방식을 개발하는 것이었습니다. 이러한 노력은 말초 혈액에서 NET을 추출하는 전통적인 방법과 관련된 제한으로 인해 발생했으며, 주로 분리에 사용할 수 있는 호중구가 부족하기 때문입니다. 이 연구는 골수에서 쥐 호중구를 얻기 위한 두 가지 뚜렷한 방법론, 즉 만족스러운 정제 수준을 산출하는 간소화된 1단계 절차와 향상된 정제 효율을 나타내는 더 많은 시간 집약적인 2단계 프로세스를 보여주었습니다. 중요한 것은, 두 기술 모두 쥐 한 마리당 5천만에서 1억 마리에 이르는 상당한 양의 생존 가능한 호중구를 산출했다는 것입니다. 이 효율성은 인간과 쥐 공급원 모두에서 호중구를 분리하여 얻은 결과를 반영했습니다. 의미심장하게도, 쥐의 골수에서 유래한 호중구는 말초 혈액에서 얻은 호중구와 비교할 때 NET을 분비하는 능력이 비슷했습니다. 그러나 골수 기반 방법은 지속적으로 호중구와 NET을 모두 현저하게 더 많이 생산했습니다. 이 접근법은 추가 다운스트림 응용 분야를 위해 이러한 세포 구성 요소를 훨씬 더 많이 얻을 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 특히, 이러한 분리된 NET과 호중구는 염증, 감염 및 자가면역 질환의 영역에 걸쳐 다양한 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.
Introduction
호중구는 선천성 면역 반응에서 중추적인 역할을 하는 백혈구의 중요한 하위 집합을 구성합니다. 이들은 다양한 프로테아제와 항균 펩타이드를 함유하는 다엽 핵과 과립을 특징으로 한다1. 호중구는 주로 탈과립화, 식균작용 및 NET의 형성을 통해 기능합니다. NET의 관찰은 1996년 Takei et al.이 호중구를 phorbol myristate acetate(PMA)2로 자극하는 실험에서 처음 이루어졌습니다. 그 후, NET 형성 과정은 2004년 Brinkmann et al.3에 의해 “NETosis”라는 용어로 만들어졌습니다. 그들의 연구는 호중구 매개 항균 반응에서 NET의 중요한 역할을 더욱 조명했습니다. NET은 크로마틴, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조로, 감염성 및 염증성 자극에 반응하여 활성화된 호중구에서 방출됩니다. NET은 침입하는 병원체를 가두고 고농도의 항균 펩타이드와 프로테아제에 노출시켜 고정시키고 죽일 수 있습니다 1,3. 또한 NET은 자가사멸 세포의 청소에 기여하고 염증 해결에 관여합니다. 최근 연구에 따르면 NET의 과도한 형성 또는 NET 분해 장애는 조직 손상, 자가면역 질환, 혈전 형성 및 혈관 재형성 장애를 유발할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10.
심근경색 및 심실동맥류 형성에 따른 조절되지 않는 섬유증에서 NET의 병원성 역할은 혈관 주위 섬유증의 확장을 통해 입증되었습니다 4,11. 심근 경색 모델과 생쥐의 골수에서 호중구를 분리하는 것은 모두 잘 확립되어 있습니다. 인간의 혈액에 풍부한 백혈구의 일종인 다형핵(PMN) 백혈구는 인간 호중구를 분리하는 훌륭한 공급원 역할을 합니다. 이 방법은 골수를 채취할 필요가 없어 안전성과 효율성이 향상됩니다.
NET은 심장 리모델링과 관련된 심방세동에서도 중요한 역할을 합니다. 그러나, 개나 돼지와 같은 큰 동물을 이용하여 심방세동을 모델링하였는데, 이는 마우스는 특정 이온 채널이나 신호전달 경로가 녹다운되거나 녹아웃되지 않는 한, 재진입 주기 또는 AF 모델을 확립할 수 있을 만큼 충분히 큰 심방이 없기 때문이다12. 앞서 설명한 바와 같이 쥐의 심방세동을 유도하고 쥐의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 것이 가능하지만, 연구자들은 말초 혈액에서 2 x 105-5 x 105 호중구만 분리할 수 있다는 한계에 부딪혔습니다(쥐당 10mL). 각 시점에서 충분한 NET을 추출하려면 약 10-25마리의 쥐(총 5 x 106 개의 호중구)가 필요했으며, 그 결과 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 종종 수율이 낮은 공정이 발생했다13. 이와 관련하여, Li He와 동료들은 쥐로부터 적절한 NET을 얻기 위한 골수 지향 전략을 제시한다14. 이 논문에서 그들은 쥐 골수에서 호중구를 분리하는 방법에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 쥐 말초 호중구와 골수 호중구의 NET 분비 능력을 비교합니다. 개괄된 두 가지 방법은 서로 다른 실험 목표를 충족하며, 둘 다 필요한 쥐의 수를 줄이면서 충분한 양의 쥐 골수 호중구를 생성합니다. 2단계 분리 방법은 우수한 호중구 정제를 입증한 반면, 1단계 분석법은 허용 가능한 정제 수준으로 시간 효율적인 것으로 입증되었습니다. 또한, 연구진은 쥐의 골수 호중구와 말초 호중구 사이의 NETosis 및 NET 형성을 비교하여 PMN과 동일한 효능을 발견했습니다. 이러한 발견은 심방세동의 호중구 관련 연구에 크게 기여하고 호중구 분포가 다른 다양한 실험 동물에서 호중구 분리를 위한 다양한 소스를 유연하게 선택하는 것의 중요성을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
호중구의 분리는 NETosis를 연구하는 데 있어 중추적인 단계를 구성하며, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 적절한 분리 방법을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 고려해야 할 중요한 요소는 격리 중 림프구 오염의 발생입니다. 이 문제를 해결하는 것은 골수에서 쥐 호중구를 분리할 때 특히 중요합니다. 림프구(1.0337-1.0765, 최대 1.0526)에 비해 호중구(1.0814-1.0919, 최대 1.0919)의 뚜렷한 밀도 범위에도…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
자금 지원: 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(Nos. 82004154, 81900311, 82100336 및 81970345)의 지원을 받았습니다.
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
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