同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ
Summary
この研究では、ラットの骨髄から豊富な好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための2つの技術について概説しています。1 つの方法は、市販の好中球分離キットと密度勾配遠心分離を組み合わせたもので、もう 1 つは密度勾配遠心分離のみを採用した方法です。どちらのアプローチも、末梢血好中球由来のNETを凌駕する機能的なNETを生成します。
Abstract
この研究の主な目的は、ラットの骨髄から好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための信頼性が高く効率的なアプローチを開発することでした。この取り組みは、末梢血からNETを抽出する従来の方法に関連する制限、主に単離に利用できる好中球の不足のために生じました。この研究では、骨髄からラット好中球を得るための2つの異なる方法論が明らかになりました:満足のいく精製レベルをもたらす合理化された1ステップ手順と、精製効率の向上を示すより時間のかかる2ステッププロセス。重要なことは、どちらの技術も、ラットあたり5000万から1億の範囲のかなりの量の生存可能な好中球を産出したことです。この効率は、ヒトとマウスの両方の供給源から好中球を単離して得られた結果を反映しています。重要なことに、ラットの骨髄に由来する好中球は、末梢血から得られた好中球と比較して、NETを分泌する同等の能力を示しました。しかし、骨髄ベースの方法では、好中球とNETの両方が一貫して著しく大量に産生されました。このアプローチは、さらなる下流のアプリケーションのために、これらの細胞成分を大幅に大量に入手できる可能性を示しました。特に、これらの単離されたNETと好中球は、炎症、感染症、自己免疫疾患の領域にまたがるさまざまな用途に有望です。
Introduction
好中球は、自然免疫応答において極めて重要な役割を果たす白血球の重要なサブセットを構成します。それらは、さまざまなプロテアーゼと抗菌ペプチドを含む多葉核および顆粒によって特徴付けられます1。好中球は、主に脱顆粒、食作用、およびNETの形成によって機能します。NETの観察は、1996年に武井らによって、好中球を酢酸ホルボール(PMA)で刺激する実験で初めて行われました2。その後、NETの形成過程は、2004年にBrinkmannらによって「NETosis」と命名されました3。彼らの研究は、好中球を介した抗菌反応におけるNETの重要な役割をさらに明らかにしました。NETは、クロマチン、ヒストン、抗菌タンパク質で構成されるウェブ状の構造で、感染性および炎症性の刺激に応答して活性化好中球から放出されます。NETは、侵入した病原体を捕捉し、高濃度の抗菌ペプチドやプロテアーゼに曝露させることで、病原体を固定化して死滅させることができます1,3。さらに、NETはアポトーシス細胞のクリアランスに寄与し、炎症の解消に関与します。最近の研究では、NETの過剰な形成またはNET分解の障害は、組織損傷、自己免疫疾患、血栓形成、および血行再建術の障害につながる可能性があることも示されています4,5,6,7,8,9,10。
心筋梗塞後の制御不能な線維症および心室動脈瘤の形成におけるNETの病原性の役割は、血管周囲線維症の拡大を通じて実証されている4,11。心筋梗塞モデルとマウスの骨髄からの好中球の分離は、どちらも十分に確立されています。ヒトの血液に豊富に存在する白血球の一種である多形核(PMN)白血球は、ヒト好中球を分離するための優れた供給源として機能します。この方法により、骨髄を採取する必要がなくなるため、安全性と効率が向上します。
NETは、心臓リモデリングに関連する心房細動にも関与しています。しかし、マウスは、特定のイオンチャネルまたはシグナル伝達経路がノックダウンまたはノックアウトされない限り、リエントラントサイクルまたはAFモデルを確立するのに十分な大きさの心房を欠いているため、犬や豚などの大型動物が心房細動のモデル化に利用されました12。前述のように、ラットに心房細動を誘発し、ラットの末梢血から好中球を分離することは可能ですが、研究者は、末梢血から2 x 105-5 x 105 の好中球しか分離できないという制限に直面しました(ラットあたり10 mL)。各時点で十分なNETを抽出するには、約10〜25匹のラット(合計で5 x 106 の好中球)が必要であり、時間と費用がかかり、しばしば収率の低いプロセスになりました13。この点に関して、Li Heらは、ラットから適切なNETを得るための骨髄指向戦略を提示している14。この論文では、ラットの骨髄から好中球を単離する方法を包括的に説明し、ラットの末梢好中球と骨髄好中球の正味分泌能力を比較しています。概説した2つの方法は、異なる実験目標に対応しており、どちらも十分な量のラット骨髄好中球を得られると同時に、必要なラットの数を減らすことができます。2段階の単離法は優れた好中球精製を示し、1段階の分離法は許容可能な精製レベルで時間効率が良いことが証明されました。さらに、研究者らは、ラットの骨髄好中球とその末梢の対応物との間のNETosisとNET形成を比較し、PMNと同等の効力を発見しました。これらの知見は、心房細動の好中球関連研究に大きく貢献し、好中球分布の異なる様々な実験動物において、好中球分離のための異なる供給源を柔軟に選択することの重要性を強調しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
好中球の単離は、NETosisの研究において極めて重要なステップであり、信頼できる結果を得るためには、適切な単離方法の選択が最も重要です。重み付けする重要な要素は、単離中のリンパ球汚染の発生です。この課題に対処することは、ラットの好中球を骨髄から単離する場合に特に重要です。リンパ球(1.0337-1.0765、ピーク1.0526)と比較して好中球の密度範囲(1.0814-1.0919、ピークは1.0919)が異な…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金提供:この研究は、中国国家自然科学基金会(第82004154号、81900311号、82100336号、81970345号)の支援を受けました。
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
