Karşılaştırılabilir Kapasiteye Sahip Sıçan Kemik İliği Nötrofillerini İzole Etmek için Benzersiz Yaklaşım
Summary
Bu araştırma, sıçan kemik iliğinden bol miktarda nötrofil hücre dışı tuzakları (NET’ler) izole etmek için iki tekniği özetlemektedir. Bir yöntem, ticari bir nötrofil izolasyon kitini yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birleştirirken, diğeri yalnızca yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi kullanır. Her iki yaklaşım da periferik kan nötrofillerinden daha iyi fonksiyonel NET’ler verir.
Abstract
Bu araştırmanın temel amacı, sıçan kemik iliğinden nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET’ler) izole etmek için güvenilir ve etkili bir yaklaşım geliştirmekti. Bu çaba, NET’lerin periferik kandan çıkarılmasına yönelik geleneksel yöntemle ilişkili sınırlamalar nedeniyle, esas olarak izolasyon için mevcut nötrofillerin kıtlığı nedeniyle ortaya çıkmıştır. Çalışma, kemik iliğinden sıçan nötrofilleri elde etmek için iki farklı metodoloji ortaya çıkardı: tatmin edici saflaştırma seviyeleri sağlayan aerodinamik tek aşamalı bir prosedür ve gelişmiş saflaştırma verimliliği sergileyen daha yoğun iki aşamalı bir süreç. Daha da önemlisi, her iki teknik de sıçan başına 50 ila 100 milyon arasında değişen önemli miktarda canlı nötrofil verdi. Bu verimlilik, hem insan hem de fare kaynaklarından nötrofillerin izole edilmesinden elde edilen sonuçları yansıtıyordu. Önemli bir şekilde, sıçan kemik iliğinden türetilen nötrofiller, periferik kandan elde edilen nötrofillerle karşılaştırıldığında, NET’leri salgılamak için karşılaştırılabilir yetenekler sergiledi. Bununla birlikte, kemik iliği bazlı yöntem sürekli olarak hem nötrofillerin hem de NET’lerin önemli ölçüde daha büyük miktarlarda üretildi. Bu yaklaşım, daha sonraki aşağı akış uygulamaları için bu hücresel bileşenlerden önemli ölçüde daha fazla miktarda elde etme potansiyelini göstermiştir. Özellikle, bu izole NET’ler ve nötrofiller, inflamasyon, enfeksiyon ve otoimmün hastalıklar alanlarını kapsayan bir dizi uygulama için umut vaat ediyor.
Introduction
Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynayan lökositlerin kritik bir alt kümesini oluşturur. Çeşitli proteazlar ve antimikrobiyal peptitler içeren çok loblu çekirdekler ve granüller ile karakterize edilirler1. Nötrofiller öncelikle degranülasyon, fagositoz ve NET oluşumu yoluyla işlev görür. NET’lerin gözlemi ilk olarak 1996 yılında nötrofillerin forbol miristat asetat (PMA)2 ile uyarıldığı bir deney sırasında Takei ve ark. tarafından yapılmıştır. Daha sonra, NET oluşum süreci 2004 yılında Brinkmann ve ark.3 tarafından “NETosis” olarak adlandırılmıştır. Araştırmaları, NET’lerin nötrofil aracılı antimikrobiyal yanıtlardaki önemli rolünü daha da aydınlattı. NET’ler, enfeksiyöz ve enflamatuar uyaranlara yanıt olarak aktive edilmiş nötrofillerden salınan kromatin, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. NET’ler, istilacı patojenleri yakalayarak ve yüksek konsantrasyonda antimikrobiyal peptitlere ve proteazlaramaruz bırakarak hareketsiz hale getirebilir ve öldürebilir 1,3. Ek olarak, NET’ler apoptotik hücrelerin temizlenmesine katkıda bulunur ve inflamasyonun çözülmesine katılır. Son çalışmalar ayrıca aşırı NET oluşumunun veya bozulmuş NET bozulmasının doku hasarına, otoimmün bozukluklara, trombogeneze ve bozulmuş revaskülarizasyona yol açabileceğini göstermektedir 4,5,6,7,8,9,10.
Miyokard enfarktüsünü takiben kontrolsüz fibrozis ve ventriküler anevrizmaların oluşumunda NET’lerin patojenik rolü, perivasküler fibrozisin genişlemesi ile gösterilmiştir 4,11. Miyokard enfarktüsü modeli ve farelerde kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu iyi bilinmektedir. İnsan kanında bol miktarda bulunan bir tür beyaz kan hücresi olan polimorfonükleer (PMN) lökositler, insan nötrofillerini izole etmek için mükemmel bir kaynak görevi görür. Bu yöntem, kemik iliği toplama ihtiyacını ortadan kaldırarak güvenliği ve verimliliği artırır.
NET’ler ayrıca kardiyak yeniden şekillenme ile ilişkili atriyal fibrilasyonda da rol oynar. Bununla birlikte, köpekler ve domuzlar gibi büyük hayvanlar, atriyal fibrilasyonu modellemek için kullanıldı, çünkü fareler, belirli iyon kanalları veya sinyal yolları devrilmedikçe veya nakavt edilmedikçe, yeniden giriş döngüsü veya AF modeli oluşturacak kadar büyük bir atriyumdan yoksundur12. Sıçanlarda atriyal fibrilasyonu indüklemek ve daha önce tarif edildiği gibi sıçan periferik kanından nötrofilleri izole etmek mümkün olsa da, araştırmacılar periferik kandan sadece 2 x 105-5 x10 5 nötrofilin izole edilebileceği bir sınırlama ile karşılaştılar (sıçan başına 10 mL). Her zaman noktasında yeterli NET’in çıkarılması yaklaşık 10-25 sıçan (toplamda 5 x 106 nötrofil) gerektirdi, bu da zaman alıcı, pahalı ve genellikle düşük verimli bir süreçlesonuçlandı 13. Bu bağlamda, Li He ve meslektaşları, sıçanlardan yeterli NET elde etmek için kemik iliği odaklı bir strateji sunmaktadır14. Makalelerinde, sıçan kemik iliğinden nötrofillerin izole edilmesinin kapsamlı bir tanımını sunuyorlar ve sıçan periferik ve kemik iliği nötrofillerinin NET salgılama yeteneklerini karşılaştırıyorlar. Özetlenen iki yöntem, her ikisi de gerekli sıçan sayısını azaltırken yeterli miktarda sıçan kemik iliği nötrofili ile sonuçlanan farklı deneysel hedeflere hitap etmektedir. İki aşamalı izolasyon yöntemi, üstün nötrofil saflaştırması gösterirken, tek aşamalı yöntem, kabul edilebilir saflaştırma seviyeleri ile zaman açısından verimli olduğunu kanıtladı. Ayrıca, araştırmacılar sıçan kemik iliği nötrofilleri ile periferik muadilleri arasındaki NETosis ve NET oluşumunu karşılaştırdılar ve PMN ile eşit etki buldular. Bu bulgular, atriyal fibrilasyonun nötrofil ile ilgili çalışmalarına önemli ölçüde katkıda bulunur ve farklı nötrofil dağılımlarına sahip çeşitli deney hayvanlarında nötrofil izolasyonu için farklı kaynakların esnek bir şekilde seçilmesinin önemini vurgular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nötrofillerin izolasyonu, güvenilir sonuçlar elde etmek için uygun bir izolasyon yönteminin seçilmesinin çok önemli olduğu NETosis çalışmasında çok önemli bir adım oluşturur. Tartılması gereken önemli bir faktör, izolasyon sırasında lenfosit kontaminasyonunun meydana gelmesidir. Bu zorluğun ele alınması, sıçan nötrofillerini kemik iliğinden izole ederken özellikle önemlidir. Lenfositlere (1.0337-1.0765, 1.0526’da bir zirve ile) kıyasla nötrofillerin farklı yoğunluk aralığına (1.0814…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman: Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004154, 81900311, 82100336 ve 81970345) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
