Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters
Summary
Dit protocol biedt een efficiënte en goedkope methode speurder Zika virus te bepalen van doelen in menselijke urine en serum monsters of muggen door omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP). Deze methode vereist geen RNA isolatie en kan worden gedaan binnen 30 min.
Abstract
Infectie met Zika-virus (ZIKV) kan asymptomatisch bij volwassenen, echter de infectie tijdens de zwangerschap kan leiden tot miskraam en ernstige neurologische tekorten van de geboorte. Het doel van dit protocol is te snel opsporen van ZIKV in zowel de mens als de mug monsters. De huidige gouden standaard voor ZIKV-detectie is kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (qRT-PCR); omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) kan toestemming geven voor een meer efficiënte en goedkope testen zonder de noodzaak voor dure apparatuur. In deze studie, wordt RT-LAMP gebruikt voor de detectie van de ZIKV in verschillende biologische monsters binnen 30 min, zonder eerste isoleren RNA van het monster. Deze techniek wordt aangetoond met behulp van ZIKV geïnfecteerde patiënt urine en serum, en besmette mug monsters. 18s ribosomal RNA zuur en actine worden gebruikt als besturingselementen in mens- en muskietenhuif monsters, respectievelijk.
Introduction
In 2015, Zika-virus (ZIKV) die is opgedaan vooraanstaande wereldwijde aandacht als een besmettelijke ziekte van zorg omdat de infectie tijdens de zwangerschap was gekoppeld aan een miskraam, doodgeboorte, ernstige neurologische tekorten van de geboorte met inbegrip microcefalie, evenals andere aangeboren aangeboren afwijkingen1. In zeldzame gevallen geweest ZIKV geassocieerd met Guillain-Barré syndroom. ZIKV wordt vooral overgedragen door Aedes -muggen; het kan echter ook worden verspreid via seksueel contact1. Gezien het feit dat de infectie met ZIKV asymptomatisch in de meeste mensen of geschenken met milde griep-achtige symptomen die overlappen met de symptomen van infectie van andere arborviruses1, was er behoefte aan een verbeterde methoden voor snelle en kostenefficiënte detectie van ZIKV om het scherm zowel mensen als lokale mug populaties.
Kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (qRT-PCR) is een betrouwbare test voor de opsporing van ZIKV; Deze techniek vereist echter duur gespecialiseerde apparatuur, opgeleid personeel en RNA isolatie uit de steekproef van belang. Omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) is een one-step nucleïnezuur amplificatie methode gebaseerd op technologie van PCR die slechts één incubatietemperatuur als gevolg van het gebruik van een thermophilic polymerase van DNA met strand vereist de eigenschappen van de verplaatsing. Dit omzeilt de behoefte aan een thermocycler en vermindert de lengte van de tijd die nodig is voor het voltooien van de test. Extra voordelen van RT-LAMP zijn haar hoge specificiteit, de gevoeligheid en de robuustheid bij een bereik van pH niveaus en temperaturen en weerstand tegen vele PCR remmers2. Het heeft een relatief lage kostprijs en reagentia zijn stabiel bij kamertemperatuur. Gegeven deze kenmerken, kan RT-LAMP worden geïmplementeerd in een laboratorium of in het veld. Als zodanig, zijn LAMP reacties ontwikkeld voor het detecteren van een scala van ziekteverwekkers en andere soorten infectie3,4,5. Het doel van het protocol van de RT-LAMP in dit artikel wordt beschreven is om ZIKV detecteren zonder RNA isolatie in menselijk serum en de urine monsters zo goed als in een enkele geïnfecteerde mug binnen 30 min door RT-LAMP. Deze methode kan worden gebruikt ter vervanging van qRT-PCR, want het is een gevoelige en snelle diagnostische tool die snel en in instellingen buiten het laboratorium werkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bepaling van ZIKV RT-LAMP in dit papier werkt met behulp van zowel de mens als de mug monsters6beschreven. De limiet van detectie was ongeveer 1 genoom gelijkwaardig6, dat voldoende moeten zijn zou aangezien de typische virale lading van een symptomatische patiënt van de ZIKV besmet 10 is3 te 106 PFU/mL7. Daarnaast kan deze methode ZIKV detecteren in monsters zonder eerste isoleren RNA en zonder versterking van v…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Maureen en Ronald Hirsch familie filantropische bijdrage en veld Neurosciences Institute, St. Mary’s van Michigan. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. Wij danken ook Dr. Bernadette Zwaans en Elijah Ward voor hun kritische evaluatie van het manuscript.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
Referenzen
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
