Reverse Transkription-Loop-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) Assay für Zika-Virus und Housekeeping-Gene in Urin, Serum und Moskito-Proben
Summary
Dieses Protokoll bietet eine effiziente und kostengünstige Methode zum Zika Virus erkennen oder steuern Ziele im menschlichen Urin und Serum-Proben oder Mücken durch reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Amplifikation (RT-Lampe). Diese Methode erfordert keine RNA isoliert und kann innerhalb von 30 Minuten erfolgen.
Abstract
Infektion mit Zika-Virus (ZIKV) kann bei Erwachsenen asymptomatisch sein, jedoch Infektion während der Schwangerschaft kann zu fehl- und schwere neurologische Geburtsschäden führen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ZIKV in Menschen- und Moskito Proben schnell zu erkennen. Der derzeitige Goldstandard für ZIKV Erkennung ist quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR); reversen Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) kann für eine effiziente und kostengünstige Prüfung ohne die Notwendigkeit für teure Ausrüstung. In dieser Studie dient RT-Lampe ZIKV-Erkennung in verschiedenen biologischen Proben innerhalb von 30 min ohne erste Isolierung der RNS aus der Probe. Diese Technik wird gezeigt, mit ZIKV infizierten Patienten Urin und Serum und infizierten Mücke Proben. 18 s ribosomalen Ribonukleinsäure und Aktin werden als Steuerelemente in Menschen- und Moskito Proben verwendet.
Introduction
Im Jahr 2015 sammelte Zika-Virus (ZIKV) Prominente weltweite Aufmerksamkeit als eine Infektionskrankheit von Sorge denn Infektion während der Schwangerschaft mit fehl-, Totgeburt, schwere neurologische Geburtsschäden einschließlich Mikrozephalie sowie andere angeborene verbunden war Geburtsschäden1. In seltenen Fällen wurde ZIKV mit Guillain-Barré-Syndrom. ZIKV ist in erster Linie von Aedes -Mücken übertragen; Es kann jedoch auch durch sexuellen Kontakt1verteilt werden. Angesichts der Tatsache, dass die Infektion mit ZIKV bei den meisten Menschen asymptomatisch ist oder präsentiert mit milden grippeähnlichen Symptomen, die sich überschneiden mit den Symptomen einer Infektion von anderen Arborviruses1, gab es eine Notwendigkeit für bessere Methoden zur schnellen und kostengünstigen Nachweis von ZIKV sowohl Menschen als auch lokale Moskito-Populationen auf den Bildschirm.
Quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR) ist ein zuverlässiger Test zur ZIKV Erkennung; Diese Technik erfordert jedoch teure Spezialausrüstung, geschultes Personal und RNA-Isolierung aus der Stichprobe von Interesse. Reversen Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) ist eine einstufige Nukleinsäure-Amplifikation Methode basiert auf PCR-Technologie, die nur eine Inkubationstemperatur durch den Einsatz einer thermophilen DNA-Polymerase mit Strang erfordert Verschiebung-Eigenschaften. Dies umgeht die Notwendigkeit für ein Thermocycler und verringert die Länge der Zeit benötigt, um den Test abzuschließen. Weitere Vorteile des RT-Lampe sind seine hohe Spezifität und Sensitivität, Robustheit bei einer Reihe von pH-Werten und Temperaturen und Resistenz gegen viele PCR-Inhibitoren2. Es hat einen relativ niedrigen Kosten und Reagenzien sind bei Raumtemperatur stabil. Angesichts dieser Merkmale, kann RT-Lampe in einem Labor oder im Feld eingesetzt werden. Als solche sind Lampe Reaktionen entwickelt worden, um eine Reihe von Krankheitserregern und anderen Arten von Infektion3,4,5zu erkennen. Das Ziel des RT-Lampe-Protokolls, die in diesem Dokument beschriebenen ist, ZIKV ohne RNA Isolierung im menschlichen Serum und Urin Proben sowie einen einzigen infizierten Mücke innerhalb von 30 min durch RT-Lampe zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, um qRT-PCR zu ersetzen, wie es ist eine sensible, schnelle Diagnose-Tool, die schnell und in den Einstellungen außerhalb des Labors arbeitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die ZIKV RT-Lampe-Assay in diesem Papierarbeiten mit Menschen- und Moskito Proben6beschrieben. Der Nachweisgrenze wurde ca. 1 Genom entspricht6, was ausreichen sollte, da die typische Viruslast eines symptomatischen ZIKV infizierten Patienten 103 bis 106 PFU/mL7. Darüber hinaus kann diese Methode ZIKV in Proben ohne erste isolierende RNA und ohne Verstärkung der Virus in der Zellkultur erkennen. Dies verringert deu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Maureen und Ronald Hirsch Familie philanthropischen Beitrag und Neurowissenschaften Feldinstitut, St. Maria von Michigan unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir danken auch Dr. Bernadette Zwaans und Elijah Ward für ihre kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
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