Essais de Transcription-boucle-négociée l’Amplification isotherme (RT-lampe) pour Virus Zika et gènes domestiques dans l’Urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse
Summary
Ce protocole fournit une méthode efficace et peu coûteux pour détecter le virus Zika ou contrôler des cibles dans des échantillons d’urine et le sérum humains ou chez les moustiques par amplification isotherme boucle-négociée de transcription inverse (RT-lampe). Cette méthode ne nécessite pas d’ARN et peut se faire dans les 30 minutes.
Abstract
Infection par le virus Zika (ZIKV) peut être asymptomatique chez l’adulte, cependant, infection pendant la grossesse peut entraîner une fausse couche et de graves malformations neurologiques. Ce protocole vise à détecter rapidement les ZIKV dans des échantillons humains et de moustiques. L’étalon-or actuel pour la détection de ZIKV est la transcription inverse quantitative PCR (qRT-PCR) ; l’amplification isotherme boucle-négociée la transcription inverse (RT-lampe) peut permettre un test plus efficace et à moindre coût sans besoin de matériel coûteux. Dans cette étude, RT-lampe est utilisée pour la détection de ZIKV dans divers échantillons biologiques dans les 30 minutes, sans premier isoler l’ARN de l’échantillon. Cette technique est démontrée en utilisant ZIKV infectés par le sérum et l’urine de patients et infecté des échantillons de moustiques. L’acide ribonucléique ribosomique 18 s et l’actine sont utilisés comme témoins dans des échantillons humains et moustique, respectivement.
Introduction
En 2015, Zika virus (ZIKV) attiré l’attention mondiale éminente comme une maladie infectieuse des préoccupations parce que l’infection pendant la grossesse était liée à la fausse couche, de mortinatalité, de graves neurologiques congénitales incluant une microcéphalie, ainsi qu’autres congénitale 1de malformations congénitales. Dans de rares cas, ZIKV a été associée avec le syndrome de Guillain-Barré. ZIKV est principalement transmis par les moustiques du genre Aedes ; Toutefois, il peut également se propager par contact sexuel1. Étant donné que l’infection avec ZIKV est asymptomatique chez la plupart des gens ou présente avec grippe-comme des symptômes bénins qui se chevauchent avec les symptômes de l’infection à d’autres arborviruses1, il y avait un besoin d’amélioration des méthodes de détection rapide et rentable de ZIKV pour dépister les personnes ainsi que les populations de moustiques locaux.
La transcription inverse quantitative PCR (qRT-PCR) est une méthode fiable pour la détection de ZIKV ; Cependant, cette technique nécessite de coûteux équipements spécialisés, un personnel formé et isolement d’ARN de l’échantillon d’intérêt. L’amplification isotherme boucle-négociée la transcription inverse (RT-lampe) est un procédé d’amplification d’acide nucléique one-step basé sur la technologie PCR qui exige seulement une température d’incubation en raison de l’utilisation d’une ADN polymérase thermophile avec fil Propriétés de déplacement. Cela contourne la nécessité d’un thermocycleur et diminue la longueur du temps nécessaire pour effectuer le test. Avantages supplémentaires de RT-lampe incluent sa grande spécificité et la sensibilité, la robustesse à un éventail de niveaux de pH et températures et résistance aux nombreux PCR inhibiteurs2. Il a un coût relativement faible et les réactifs sont stables à température ambiante. Compte tenu de ces caractéristiques, RT-lampe peut être déployé dans un laboratoire ou sur le terrain. À ce titre, les réactions de lampe ont été développées pour détecter un éventail d’agents pathogènes et d’autres types d’infection3,4,5. L’objectif du protocole RT-lampe décrit dans le présent document est de détecter les ZIKV sans isolement d’ARN dans les échantillons de sérum et l’urine humaines ainsi que dans un seul moustique infecté dans les 30 minutes par l’intermédiaire de RT-lampe. Cette méthode peut être utilisée pour remplacer qRT-PCR car c’est un outil de diagnostic sensible et rapid qui fonctionne rapidement et dans des cadres à l’extérieur du laboratoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de ZIKV RT-lampe décrit dans cette étude des œuvres à l’aide de fois l’homme et les moustiques échantillons6. La limite de détection était environ 1 génome équivalent6, qui devrait être suffisant puisque la charge virale typique d’un patient ZIKV infecté symptomatique est 103 à 106 UFP/mL7. En outre, cette méthode peut détecter des ZIKV dans les échantillons sans premier isolement RNA e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la contribution philanthropique familiale Maureen et Ronald Hirsch et champ Institut des Neurosciences, Sainte Marie de Michigan. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. Nous remercions également Mme Bernadette Zwaans et Elijah Ward pour leur examen critique du manuscrit.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
Referenzen
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