הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה, בעלות נמוכה לזהות וירוס Zika או שליטה מטרות בדגימות שתן וסרום אנושי או יתושים על ידי שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה). שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA והוא יכול להיעשות תוך 30 דקות.
Abstract
זיהום בנגיף Zika (ZIKV) יכול להיות אסימפטומטיים במבוגרים, לעומת זאת, זיהום במהלך ההריון יכול לגרום להפלה מולדים נוירולוגיות חמורות. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות במהירות ZIKV בדגימות האדם והן יתושים. תקן הזהב הנוכחי לגילוי ZIKV הוא שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR); שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) עשוי לאפשר לבדיקה יותר יעיל, בעלות נמוכה ללא צורך ציוד יקר. במחקר זה, RT-המנורה שימוש לצורך זיהוי ZIKV בדגימות ביולוגיות שונות בתוך 30 דקות, ללא הראשונה לבודד את הרנ א מדגם. טכניקה זו הוכח שימוש ZIKV נגוע סרום ושתן המטופל ולאחר נגוע דגימות יתושים. חומצה ריבונוקלאית ribosomal 18S אקטין משמשים כפקדי בדגימות האדם וכילה נגד יתושים, בהתאמה.
Introduction
בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV) צבר תשומת הלב העולמית בולטים כמו מחלה זיהומית של דאגה מפני זיהום במהלך ההריון היה קשור להפלה, לידות, חמור נוירולוגיות מומים מולדים כולל microcephaly, כמו גם אחרים מולדת מומים מולדים1. במקרים נדירים, ZIKV נמצא קשור תסמונת גיליאן. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושי אאדס; עם זאת, זה יכול גם להיות להתפשט באמצעות מגע מיני1. בהתחשב בכך הזיהום עם ZIKV ללא תסמינים אצל רוב האנשים, או מציג עם מתון תסמינים דמויי שפעת חופפים עם הסימפטומים של זיהום של אחרים arborviruses1, היה צורך עבור שיפור שיטות גילוי מהירה וחסכונית של ZIKV למסך גם אנשים, כמו גם אוכלוסיות יתוש מקומיים.
שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR) הוא assay אמין לצורך זיהוי ZIKV; עם זאת, טכניקה זו דורש ציוד מיוחד יקר, צוות מיומן, ובידוד RNA מדגם של ריבית. שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) היא שיטה הגברה חומצת גרעין בשלב אחד מבוסס על טכנולוגיית ה-PCR הדורש רק בטמפרטורת דגירה אחת עקב השימוש לרום DNA פולימראז עם סטרנד מאפייני העקירה. זה עוקף את הצורך thermocycler, מקטין את משך הזמן הדרוש כדי להשלים את הבדיקה. יתרונות נוספים של RT-המנורה כוללים שלה ירידה לפרטים גבוהה, רגישות, חוסן במגוון של רמות ה-pH, טמפרטורות, והתנגדות PCR רבים מעכבי2. יש יחסית נמוכים, ריאגנטים יציבים בטמפרטורת החדר. לאור מאפיינים אלה, RT-המנורה ניתן לפרוס במעבדה או בשטח. ככזה, המנורה תגובות פותחו כדי לזהות מגוון של פתוגנים וסוגים אחרים של זיהום3,4,5. המטרה של פרוטוקול RT-המנורה המתוארת במאמר זה היא לזהות את ZIKV ללא בידוד RNA בדגימות האנושי סרום ושתן באותה מידה כמו יתוש הנגוע יחיד בתוך 30 דקות באמצעות RT-המנורה. בשיטה זו ניתן להחליף לרביעיית-PCR כפי שהוא כלי אבחון רגיש, מהירה שפועל במהירות ובאופן בהגדרות מחוץ למעבדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
וזמינותו ZIKV RT-המנורה המתוארת בעלון זה עבודות נייר באמצעות דגימות של האדם והן יתושים-6. המגבלה של זיהוי היה כ 1 גנום שוות ערך6, אשר אמורה להספיק מאז המטען הנגיפי טיפוסי של חולה סימפטומטי ZIKV נגוע הוא 103 כדי 6 10 PFU/mL7. בנוסף, שיטה זו יכול לזה?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תרומה פילנתרופית משפחה מורין, רונלד הירש שדה מכון מדעי המח, כנסיית מריה הקדושה של מישיגן. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. אנו מודים גם ד ר ברנדט Zwaans, אליהו וורד עבור שלהם סקירה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
Referenzen
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
