반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

Summary

이 프로토콜 Zika 바이러스 탐지 또는 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)에 의해 대상 인간의 소변 및 혈 청 샘플 또는 모기를 제어 하는 효율적이 고 저렴 한 비용 메서드를 제공 합니다. 이 메서드는 RNA 격리는 필요 하지 않습니다 하 고 30 분 이내 할 수 있습니다.

Abstract

그러나 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 성인 무 증상 일 수 있다,, 임신 중 감염 유산 및 심각한 신경 기형이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 신속 하 게 모두 인간과 모기 샘플에서 ZIKV를 검색 하는 것입니다. ZIKV 검출에 대 한 현재 금 표준 이다 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR); 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)은 보다 효율적이 고 저렴 한 비용 테스트 고가의 장비에 대 한 필요 없이 수 있습니다. 본이 연구에서는 실시간 램프 첫 샘플에서 RNA를 분리 하지 않고 ZIKV 검출 다양 한 생물 학적 샘플 30 분 이내에 사용 됩니다. 이 기술은 ZIKV를 사용 하 여 환자 소변 및 혈 청, 감염 및 감염 모기 샘플 시연입니다. 18S ribosomal ribonucleic 산과 말라 각각 인간과 모기 샘플에서 컨트롤로 사용 됩니다.

Introduction

2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV) 주목 저명한 글로벌 관심사의 전염 성 질환으로 임신 중에 감염 유산, 사 산, microcephaly, 뿐만 아니라 다른 선 천 성 신경 심각한 출생 결함에 연결 했다 때문에 출생 결함¹. 드문 경우에, ZIKV Guillain-바레 증후군과 연결 되었습니다. ZIKV는 주로 Aedes 모기;로 전송 그러나, 그것은 또한 성적 접촉¹통해 확산 하실 수 있습니다. ZIKV 감염 대부분의 사람에서 무 증상 또는 다른 arborviruses¹의 감염의 증상과 겹치는 가벼운 감기 같은 증상으로 선물 한다, 그의 신속 하 고 비용 효율적인 검색을 위한 향상 된 방법 필요가 했다 사람 뿐만 아니라 현지 모기 인구를 화면에 ZIKV.

양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR)은 ZIKV 감지;에 대 한 신뢰성 분석 결과 그러나,이 기술은 고가의 특수 장비, 숙련 된 직원, 그리고 관심의 샘플에서 RNA 격리 해야합니다. 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)는만 가닥으로 thermophilic DNA 중 합 효소의 사용으로 인 한 부 화 온도 필요로 하는 PCR 기술에 따라 1 단계 핵 산 증폭 방법 변위 속성입니다. 이 thermocycler 니드 circumvents 고 분석 결과 완료 하는 데 필요한 시간을 줄입니다. RT-램프의 추가 장점 높은 특이성, 감도, 견고성 pH 수준 및 온도, 저항 많은 PCR 억제제²의 범위에 포함 됩니다. 그것은 상대적으로 저렴 한 비용 및 시 약은 실 온에서 안정. 이러한 특성을 감안할 때, RT-램프 배포할 수 있습니다 실험실에서 또는 분야에서. 등, 램프 반응 병원 체와 감염^3,,45의 다른 종류의 범위를 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 이 문서에 설명 된 RT 램프 프로토콜의 목표는 인간의 혈 청 및 소변 샘플에도 RT 램프를 통해 30 분 이내 단일 감염 된 모기에서 RNA 격리 없이 ZIKV를 감지. 그것은 실험실 밖으로 신속 하 고 설정에서 작동 민감한, 신속한 진단 도구 qRT-PCR을 대체 하이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 버몬트 건강의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 주의: 잠재적으로 전염 하는 모든 자료는 개인 보호 장비의 사용을 포함 하는 Biosafety 수준 2 기준에 따라 처리 되어야 합니다. 에 어로 졸을 생산 있습니다 어떤 절차 biosafety 내각에서 수행 되어야 합니다. 또한, 라이브 모기 사용 적절 …

Representative Results

RT-램프 반응 3 가지 방법을 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 첫째, 형광 핵 산 염료의 추가 함께 긍정적인 반응이 됩니다 노란색/녹색 색상에 부정적인 반응을 오렌지 육안으로 색상에 나타납니다. 둘째, RT 램프 반응 형광 핵 산 염료의 추가에 결과 형광 신호 샘플 UV 빛에 의해 흥분. 부정적인 반응을 소량 부정적인 컨트롤에 있을 수 있는 모든 배경 형광에 감지 형광 신호를…

Discussion

ZIKV RT-램프 분석 결과 인간과 모기 샘플⁶을 사용 하 여이 종이 작품에 설명 된. 탐지의 한계는 약 1 게놈에 해당⁶, 증상 ZIKV 감염 환자의 일반적인 바이러스 부하 이기 때문에 10 충분 해야³  10⁶ PFU/mL⁷. 또한,이 방법은 ZIKV 샘플 먼저 분리 RNA와 세포 배양에서 바이러스 증폭 없이 검색할 수 있습니다. 이 크게 시간, 비용, 및 …

Materials

Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A