İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters
Summary
Bu iletişim kuralı Zika virüs tespit veya hedefleri insan serum ve idrar örnekleri veya sivrisinekler Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon tarafından (RT-lamba) denetlemek için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem does değil istemek RNA izolasyon ve 30 dk içinde yapılabilir.
Abstract
Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon yetişkinlerde asemptomatik olabilir, ancak, gebelik sırasında enfeksiyon çocuk düşürme ve ağır nörolojik Doğum kusurları yol açabilir. Bu iletişim kuralı, hızlı bir şekilde insan ve sivrisinek ZIKV algılamak için hedeftir. ZIKV algılama için geçerli altın standart olduğunu nicel Ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR); Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (RT-lamba) bir daha verimli ve düşük maliyetli pahalı ekipmanlara gerek kalmadan test etmek için izin verebilir. Bu çalışmada, RT-lamba ZIKV algılama 30 dk içinde çeşitli biyolojik örneklerde için ilk örnekten RNA izole olmadan kullanılır. Bu tekniği kullanarak ZIKV hasta idrar ve serum enfekte ve sivrisinek örnekleri enfekte gösterilmiştir. 18s ribozomal ribonükleik asit ve aktin insan ve sivrisinek örnekleri, denetimler olarak sırasıyla kullanılır.
Introduction
Gebelik sırasında enfeksiyon bağlı için düşük, distres, microcephaly, hem de diğer konjenital dahil olmak üzere ağır nörolojik Doğum kusurları için 2015 yılında Zika virüs (ZIKV) önde gelen küresel dikkat endişe bulaşıcı bir hastalık olarak elde Doğum kusurları1. Nadir de olsa bazen ZIKV Guillain-Barré sendromu ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. ZIKV öncelikle Aedes sivrisinekler tarafından iletilir; Ancak, bu da cinsel temas1ile yayılır. Verilen bu ZIKV enfeksiyonla insanların çoğu asemptomatik veya diğer arborviruses1enfeksiyon belirtileri olan üst üste hafif grip benzeri belirtiler sunar, hızlı ve düşük maliyetli algılanması için gelişmiş yöntemler için bir ihtiyaç vardı Hem insanlar hem de yerel sivrisinek nüfus ekran ZIKV.
Nicel Ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) ZIKV algılama için güvenilir bir tahlil olduğunu; Ancak, bu teknik pahalı özel ekipman, eğitimli personel ve örnek RNA izolasyonu ilgi gerektirir. Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (RT-lamba) sadece bir kuluçka sıcaklık iplikçik ile termofilik DNA polimeraz kullanımı nedeniyle gerektirir PCR teknolojisi tabanlı bir tek adımlı nükleik asit amplifikasyon yöntemdir yer değiştirme özellikleri. Bu bir thermocycler ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve tahlil tamamlamak için gereken süreyi azaltır. RT-lamba ek avantajları şunlardır onun yüksek özgüllük ve hassasiyet, pH seviyeleri ve sıcaklıklar ve birçok PCR inhibitörleri2direnç bir mesafeden sağlamlık. Reaktifler oda sıcaklığında kararlı ve nispeten düşük maliyet vardır. Bu özellikleri göz önüne alındığında, RT-lamba bir laboratuvar veya alana dağıtılabilir. Bu nedenle, lamba tepkiler çeşitli patojenler ve diğer tür enfeksiyon3,4,5algılamak için geliştirilmiştir. Bu raporda açıklanan RT-lamba Protokolü amacı RNA izolasyon insan serum ve idrar örneklerinde de RT-lamba üzerinden 30 dk içinde tek bir virüslü sivrisinek gibi olmadan ZIKV tespit etmektir. Bu yöntem hızlı bir şekilde ve ayarları laboratuvar dışında çalışır bir duyarlı, hızlı tanı aracı olarak qRT-PCR değiştirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu kağıt işler insan ve sivrisinek örnekleri6kullanarak açıklanan ZIKV RT-lamba tahlil. Semptomatik enfekte ZIKV hastanın normal viral yük 10 olduğundan yeterli olacaktır yaklaşık 1 genom eşdeğer6, algılama sınırı olduğunu3 ‘ e 106 PFU/mL7. Ayrıca, bu yöntem ilk izole RNA ve hücre kültüründe virüsü amplifikasyon olmadan örneklerdeki ZIKV algılayabilir. Bu önemli ölçüde zaman, maliyet …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Maureen ve Ronald Hirsch aile hayırsever katkısı ve alan Nöroloji Enstitüsü, St Mary’s Michigan tarafından desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. Biz de Dr Bernadette Zwaans ve Elijah Ward el yazması onların eleştiri için teşekkür ederim.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
Referenzen
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
