Reverter a transcrição Loop-mediada por amplificação isotérmica (RT-lâmpada) ensaio para vírus Zika e Housekeeping Genes em amostras de Mosquito, soro e urina

Summary

Este protocolo fornece um método eficiente e de baixo custo para detectar vírus Zika ou controlar alvos em amostras de urina e soro humanas ou em mosquitos por amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada). Este método não requer isolamento de RNA e pode ser feito dentro de 30 min.

Abstract

Infecção com vírus Zika (ZIKV) pode ser assintomática em adultos, no entanto, a infecção durante a gravidez pode levar a aborto e neurológicos graves defeitos de nascimento. O objetivo do presente protocolo é rapidamente detectar ZIKV em amostras de ambos humanos e mosquito. O atual padrão-ouro para a deteção de ZIKV é quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR); amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada) pode permitir um teste mais eficiente e de baixo custo sem a necessidade de equipamento caro. Neste estudo, RT-lâmpada é utilizada para detecção de ZIKV em diversas amostras biológicas dentro de 30 min, sem primeiro a isolar o RNA da amostra. Esta técnica é demonstrada usando ZIKV infectados, soro e urina de paciente e infectado amostras de mosquito. O ácido ribonucleico ribossomal 18s e actina são usados como controles em amostras de humanos e mosquito, respectivamente.

Introduction

Em 2015, vírus Zika (ZIKV) ganharam atenção mundial proeminente como uma doença infecciosa de preocupação porque infecção durante a gravidez estava ligada ao aborto, morte fetal, graves defeitos congênitos neurológicos incluindo microcefalia, bem como outras doenças congênitas defeitos de nascimento¹. Em casos raros, ZIKV tem sido associado com a síndrome de Guillain-Barré. ZIKV é transmitida principalmente pelo Aedes mosquitos; no entanto, ele também pode ser transmitido através de de contato sexual¹. Dado que a infecção com ZIKV é assintomática na maioria das pessoas ou apresenta com gripe-como sintomas leves que se sobrepõem com os sintomas da infecção de outros arborviruses¹, havia uma necessidade de métodos aperfeiçoados de detecção rápida e econômica de ZIKV para as pessoas, bem como populações locais mosquito da tela.

A transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) é um ensaio confiável para a deteção de ZIKV; no entanto, esta técnica requer equipamento especializado caro, pessoal treinado e isolamento de RNA da amostra de interesse. Transcrição reversa mediada por laço amplificação isotérmica (RT-lâmpada) é um método de amplificação do ácido nucleico de uma etapa baseado na tecnologia PCR que apenas requer uma temperatura de incubação devido ao uso de uma DNA-polimerase termofílicas com vertente Propriedades de deslocamento. Isso evita a necessidade de um thermocycler e diminui o comprimento de tempo necessário para completar o ensaio. Vantagens adicionais da RT-lâmpada incluem sua alta especificidade e sensibilidade, robustez em uma variedade de níveis de pH e temperatura e resistência a muitos inibidores PCR². Tem um custo relativamente baixo e os reagentes são estáveis à temperatura ambiente. Tendo em conta estas características, RT-lâmpada pode ser implantada em um laboratório ou no campo. Como tal, as reações de luz foram desenvolvidas para detectar uma gama de patógenos e outros tipos de infecção^3,4,5. O objetivo do protocolo de RT-lâmpada descrito neste documento é detectar ZIKV sem isolamento de RNA no soro e urina amostras humanas, bem como em um único mosquito infectado dentro de 30 min por meio de RT-lâmpada. Esse método pode ser usado para substituir o qRT-PCR, que é uma ferramenta de diagnóstico sensível e rápida que funciona rapidamente e em configurações fora do laboratório.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB) de saúde de Beaumont. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Atenção: Todos os materiais potencialmente infecciosos devem ser manuseados de acordo com as normas de biossegurança nível 2, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual. Quaisquer procedimentos que podem produzir aerossol devem ser executados em uma armário de bioss…

Representative Results

Reações de RT-lâmpada podem ser analisadas usando três métodos diferentes. Primeiro, com a adição de um corante fluorescente de ácidos nucleicos, reações positivas será na cor verde/amarelo onde reações negativas aparecerão laranja na cor a olho nu. Em segundo lugar, a adição do corante para reação de RT-lâmpada fluorescente de ácidos nucleicos resulta em um sinal fluorescente quando as amostras são excitadas pela luz UV. Reações negativas não terá um sinal fluore…

Discussion

O ensaio de ZIKV RT-lâmpada descrito neste papel de trabalhos usando tanto humanos como mosquito amostras⁶. O limite de detecção foi de aproximadamente 1 genoma equivalente⁶, que devem ser suficientes, desde que a carga viral típica de um paciente ZIKV infectado sintomático é 10³ a 10⁶ PFU/mL⁷. Além disso, este método pode detectar ZIKV em amostras sem primeiro isolamento de RNA e sem amplificação do vírus…

Materials

Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A