从海兔的神经细胞培养的高分辨率成像生长锥
Summary
海兔californica神经元发展大文化的生长锥，生长锥的运动和指导的高分辨率成像的优秀。在这里，我们提出了一种海兔袋细胞神经元的剥离和电镀以及设立一个活细胞成像室的协议。
Abstract
神经生长锥的轴突，可以检测到环境中的指导线索，并传导到对相应的靶细胞的定向运动信息提示的高度能动结构。要充分了解信息，指导如何从细胞表面传输到底层的动态骨架网络，需要适合高时空分辨率的成像在活细胞的蛋白质动力学模型系统。典型的脊椎动物生长锥是太小了定量分析的F -肌动蛋白和微管动力学。从海兔海兔californica的神经元是脊椎动物的神经元的5-10倍，比大，可以很容易地在室温下保持的，是非常强大的细胞显微和生物物理测量。他们的生长锥有非常明确的细胞质地区和一个很好的描述的骨架系统。显微注射神经细胞机构可以与各种研究生长锥的运动和指导的探头。在本议定书中，我们展示了一个过程，解剖腹腔神经节，培养袋细胞神经元，并设立一个生长锥的活细胞成像的成像室。
Protocol
Discussion
海兔袋细胞神经元提供了很少的非神经元细胞的无血清神经元细胞培养系统。这些神经元生长锥形成非常大的，适合解决一些重要的细胞生物学问题。袋细胞神经元可以很容易地被操纵，并在室温下成像几个小时。使用荧光斑点显微镜（密克罗尼西亚），可以定量分析的F -肌动蛋白和微管聚合和易位动态的各种参数。这些成像工具，与最近发布的海兔的基因组信息，以及改进的表达技术，使这些神经元的一个功?…
Acknowledgements
我们想感谢我们的程序和罗德尼McPhail（生物科学系，美国普渡大学）寻求协助拍摄与编辑夹层视频瑞安Maneri（Oystercatcher制作，LLC）。在苏特尔实验室的研究是支持由美国国立卫生研究院（R01 NS049233）和Bindley生物科学中心，在美国普渡大学的资助到DMS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
