Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita
Summary
Aplysia californica neuroni sviluppare grandi coni di crescita nella cultura che sono eccellenti per imaging ad alta risoluzione della motilità del cono di crescita e di orientamento. Qui, vi presentiamo un protocollo per la dissezione e la placcatura dei neuroni borsa cellule Aplysia così come per la creazione di una camera per l'imaging cellulare dal vivo.
Abstract
Coni di crescita neuronali sono strutture altamente mobili sulla punta degli assoni in grado di rilevare segnali di orientamento per l'ambiente e trasducono queste informazioni in movimento direzionale verso la cellula bersaglio appropriato. Per comprendere pienamente come le informazioni di guida viene trasmessa dalla superficie cellulare al connesse reti dinamica del citoscheletro, si ha la necessità di un sistema modello adatto per l'imaging di cellule in vivo di proteine dinamica ad alta risoluzione temporale e spaziale. Tipici coni di crescita vertebrati sono troppo piccoli per analizzare quantitativamente F-actina e la dinamica dei microtubuli. I neuroni dalla lepre mare Aplysia californica sono 5-10 volte più grande di neuroni vertebrati, può facilmente essere conservato a temperatura ambiente e sono cellule molto robusto per micromanipolazione e misure biofisici. I loro coni di crescita sono ben definite regioni citoplasmatiche e ben descritto sistema del citoscheletro. I corpi delle cellule neuronali possono essere microiniettati con una varietà di sonde per studiare la motilità del cono di crescita e di orientamento. Nel presente protocollo si dimostra una procedura per la dissezione del ganglio addominale, la cultura dei neuroni delle cellule borsa e la creazione di una camera di imaging per l'imaging cellulare dal vivo di coni di crescita.
Protocol
Discussion
Aplysia neuroni delle cellule forniscono una borsa senza siero neuronale sistema di coltura cellulare con pochissime cellule non neuronali. Questi neuroni formano coni di crescita molto grande adatto per affrontare una serie di domande importanti nelle cellule biologiche. I neuroni delle cellule borsa può essere facilmente manipolato e ripreso a temperatura ambiente per diverse ore. Mediante microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) si può analizzare quantitativamente i vari parametri di F-actina e polimerizzazione dei microtubuli e la din…
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) per le riprese la nostra procedura e Rodney McPhail (Dipartimento di Scienze Biologiche, Purdue University) per l'assistenza con l'editing del video dissezione. La ricerca nel laboratorio di Suter è sostenuto da finanziamenti del NIH (R01 NS049233) e il Centro Bindley Bioscience alla Purdue University di DMS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
